Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

1. GRNA Ontwerp voor de CRISPR-concatemer Vector Opmerking: Het doel van dit gedeelte is om uit te leggen hoe u de beste targetingstrategie kunt kiezen en hoe u gRNA's wilt ontwerpen die specifieke overhangen voor de CRISPR-concatemervector bevatten. Ontwerp gRNA's tegen de genen die interessant zijn met behulp van een CRISPR gRNA design tool van keuze. Zie de tabel van materialen voor een voorbeeld. OPMERKING: Bij het richten op een paar paraloge genen, hoewel het mogelijk is om één gRNA per gen te ontwerpen, is het raadzaam twee gRNA's per gen te ontwerpen om de kansen te vergroten om een ​​dubbele knock-out te verkrijgen ( Figuur 1 ). Zorg ervoor dat de gRNA's de herkenningssite van Bbs I niet bevatten door gebruik te maken van een restrictie-mapping tool (zie de tabel van materialen voor een voorbeeld). Voeg specifieke overtrekken van de CRISPR-concatemer toe aan elke oligo, zoals getoond in Tabel 1 . "Voor: keep-together.within-page =" 1 "voor: keep-with-next.within-page =" always "> Cassette 1 Cassette 2 Cassette 3 Cassette 4 Sequentie (5'-3 ') CACCGG [gRNA1] GT ACCGG [gRNA2] G CCGG [gRNA3] ACACCGG [gRNA4] GTT Sequentie (5'-3 ') TAAAAC [RC-gRNA1] CC AAAAC [RC-gRNA2] C AAAC [RC-gRNA3] CTAAAAC [RC-gRNA4] CCG Tabel 1: Overhangen voor elke cassette van de CRISPR-concatemer Vector. 2. Klonen van gRNA's in de CRISPR-concatemer Vector Fosforylering en annealing van oligo's OPMERKING: Deze stap illustreert hoe tO anneale bovenste en onderste strengen voor elke gRNA oligo en hoe ze hun einden in een enkele reactie fosforyleren. Bereid het reactiemengsel voor fosforylerende oligo's en annealing boven- en onderstrengen op ijs, volgens de onderstaande instructies. OPMERKING: Alle oligo's kunnen in één reactie worden samengevoegd; Bijvoorbeeld, in het geval van een 4 gRNA-concatemervector, 8 oligo's samenvoegen. Voor 3 concatemers gebruikt u 3,0 μL gRNA topstreng (1,0 μL van elk gRNA, 10 μM, 1 μL / gRNA), 3,0 μL gRNA bodemstreng (1,0 μL van elk gRNA; 10 μM, 1 μL / gRNA), 2,0 μl T4 DNA ligasebuffer (10x), 1,0 pl T4 PNK en voeg H2O tot totaal volume van 20,0 pl. Meng goed door pipetten en laat deze in een thermocycler draaien met de volgende instellingen: 37 ° C gedurende 30 minuten, 95 ° C gedurende 5 minuten, helling tot 25 ° C bij 0.3 ° C / min, houd bij 4 ° C. Bbs ik schudde reactie OPMERKING: In deze sectie worden de voorgegloeide gRNA-oligo's in een geschikte positie van de concatemervector in één stap opgenomen door wisselende cycli van vertering en ligatie. Verdun het reactiemengsel 1: 100 in DNase / RNase-vrij water om 3 en 4 gRNA-concatemervectoren te genereren. OPMERKING: bij het klonen van 2 gRNA-concatemers is deze stap niet nodig. Monteer de Bbs I shuffling reactie op ijs, volgens de onderstaande instructies. Inclusief een negatieve controle die alleen de vector bevat. Gebruik 100 ng CRISPR-concatemervector, 10,0 μl oligomengsel, 1,0 μl BSA bevattende restrictie-enzymbuffer (10x), 1,0 μl DTT (10 mM), 1,0 μL ATP (10 mM), 1,0 μl Bbs I, 1,0 μl T7-ligase en H2O tot totaal volume van 20,0 pl. Meng goed door pipettering en loop dit in een thermocycler met de volgende instellingen: Run 50 cycli voor het klonen van 3 en 4 gRNA-concatemers en <sTrong> 25 cycli voor 2 gRNA-concatemers, beide bij 37 ° C gedurende 5 min, 21 ° C gedurende 5 min, houd bij 15 ° C bij 37 ° C, dan 4 ° C voor altijd. Exonuclease behandeling OPMERKING: Deze stap wordt sterk aanbevolen aangezien het de efficiëntie van het klonen verhoogt door het verwijderen van lijnen van gel lineariseerd DNA. Behandel de Bbs I shuffling reactie met een DNA exonuclease (zie Table of Materials ) als volgt. Neem 11,0 μl ligatiemix uit de vorige stap (2.2.3), voeg 1,5 μL exonucleasebuffer (10x), 1,5 μL ATP (10 mM), 1,0 μL DNA exonuclease toe en breng het totale volume tot 15,0 μL met water op. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min gevolgd door 70 ° C gedurende 30 min. OPMERKING: Deze stap verwijdert elk residueel gelineariseerd DNA in het mengsel en verhoogt daarmee de kloneringsefficiëntie. Gebruik 2 μL van het reactiemengsel voor transformatie in chemisch compeTent E. coli bacteriën door hitte schok 12 . OPMERKING: Alternatief kan de reactie gedurende maximaal een week bij -20 ° C worden opgeslagen. Beperking spijsvertering OPMERKING: Het doel van deze stap is om door middel van restrictievertering het succes van de kloneringsprocedure te beoordelen. Om de aanwezigheid van gRNA-inserts in de CRISPR-concatemervector te bevestigen, kies 4 tot 8 bacteriële kolonies met een inoculatielus, groei elke kloon in 4 ml LB-medium 's nachts bij 37 ° C in een orbitale shaker. Extract DNA met behulp van een plasmide miniprep kit volgens de instructies van de fabrikant (zie de Tabel van Materialen ). Digest ~ 200 ng DNA met 10 U EcoR I + 5 U Bgl II in een 10 μL reactie door het gedurende 3 uur bij 37 ° C in een bacterie-incubator te incuberen. Inclusief een afzonderlijk reactiemengsel met de corresponderende originele vector als een positieve controle voor groottevergelijking. OPMERKING: ThiS zal bevestigen of alle concatemers aanwezig zijn, aangezien deze twee restrictie-enzymen volledige concatemers zullen accijnzen. Dit zijn de verwachte maten voor elke concatemer: 2 gRNA-concatemer (800 bp), 3 gRNA-concatemer (1,2 kbp) en 4 gRNA-concatemer (1,6 kbp). Voer digestie reacties op een 1% agarosegel bij 90 V gedurende ongeveer 20 minuten. Visualiseer de gel met behulp van een UV-transilluminator. Identificeer de klonen met de juiste invoeggrootte door ervoor te zorgen dat hun bandpatroon overeenkomt met de oorspronkelijke vector en dat elk fragment de verwachte grootte heeft door een DNA-ladder te gebruiken. Digest de geselecteerde klonen met 5 U Bbs I bij 37 ° C gedurende 3 uur in een bacterie incubator. Inclusief een aparte reactiemix met de corresponderende originele vector als een controle. OPMERKING: Deze extra spijsverteringstap is om te bevestigen dat gRNA's in de juiste positie zijn gekloneerd en bijgevolg zijn alle Bbs I herkenningsplaatsen verloren gegaan. Voer digestie reacties opEen 1% agarosegel bij 90 V gedurende ongeveer 20 minuten. Beschouw als correct alleen de vectoren die niet door Bbs I worden gesneden aangezien ze alleen gRNAs bevatten. Vector sequentiebepaling OPMERKING: Het doel van deze stap is het bevestigen van de aanwezigheid van gRNA-sequenties in die vectoren die zijn geïdentificeerd als correct door restrictie-verteringsanalyse. Bevestig positieve concatemervectoren door Sanger sequencing 13 met behulp van de volgende primers: Vooruit: TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG (voor het controleren van de eerste gRNA cassette) Linker1_Forward: GACTACAAGGACGACGATGACAA (voor het controleren van de tweede gRNA cassette) Linker2_Reverse: GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT (voor het controleren van de tweede gRNA-cassette) Linker2_Forward: ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC (voor het controleren van de derde gRNA cassette) Linker3_Reverse: TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT (voor het controleren van de derde gRNA cassette) Reverse: AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG (voor het controleren van de laatste gRNAcassette) Controleer de aanwezigheid van alle gRNA's door hun sequenties te zoeken in de sequentiebepaling. 3. Transfectie van darmorganoïden door elektroporatie OPMERKING: Houd er rekening mee dat deze procedure is gebaseerd op het protocol dat door Fujii et al is gepubliceerd . In 2015, met aanpassing voor kleine darmorganoïde culturen van de muis 14 . Pre-elektroporatie OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u de maagdarmorganoïden voorbereidt voor elektroporatie door alle antibiotica en geconditioneerde media uit hun cultuurmedium te verwijderen. Dit voorkomt mogelijke toxische effecten tijdens elektroporatie. Op dag 0 van de transfectie procedure, gesplitst organoïden in een 1: 2 verhouding. OPMERKING: Intestinale organoïdeculturen kunnen worden verkregen door het uitvoeren van cryptisolatie volgens eerder ingestelde protocollen 15 . Gelieve te verwijzen naar <stRong> Tabel 2 voor alle mediasamenstellingen. Bij het splitsen van organoïden voor elektroporatie, zaaien minimaal 6 putjes van een 48-putjesplaat per transfectie. Zaad de organoids in 20 pl-kelder matrix druppels en groeien ze in WENR + Nic medium (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide) bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator (zoals eerder beschreven 15) . Op dag 2, verander het medium door WENR + Nic te vervangen door 250 μL EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (Glycogen Synthase Kinase-3 inhibitor) + Y-27632 (ROCK inhibitor), zonder antibiotica (zie tabel 2 ). OPMERKING: In alle stappen wordt de hoeveelheid medium toegevoegd aan elke putje van een 48-putjesplaat 250 μL. Op dag 3, verander het organoid medium naar EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v / v Dimethyl sulfoxide (DMSO), zonder antibiotica. Bereiding van de cellen NOTITIE:Hier beschrijven we hoe u organoïden in kleine celclusters kunt fragmenteren door mechanische en chemische dissociatie. Deze stappen zijn van cruciaal belang voor het succes van de procedure. Op dag 4, verstrooi de keldermatrixkoepels met een pipetip van 1 ml en overbreng organoïden naar een 1,5 ml buis. De inhoud van de pool van vier putjes van een 48-putjesplaat in een buis. Mechanisch breken organoïden in kleine fragmenten door pipettering omhoog en omlaag met een P200 pipet ongeveer 200 keer. Centrifuge bij kamertemperatuur, 5 minuten bij 600 x g. Verwijder het medium en resuspendeer de pellet in 1 ml van een recombinant protease van celkweekgraad (zie tabel van materialen). Incubeer bij 37 ° C gedurende maximaal 5 minuten en controleer dan een 50 μL druppel monster onder een omgekeerde lichtmicroscoop met een 4x objectief. OPMERKING: Clusters van 10-15 cellen zijn gewenst, omdat dit celoverleving na elektroporatie toeneemt. Breng de celsuspensie over naar een laagbindende 15 ml buis en stop deDissociatie door 9 ml basaal medium zonder antibiotica toe te voegen (zie tabel 2 ). Centrifugeer bij kamertemperatuur, 5 minuten bij 600 xg, doe dan de supernatant af en verwijder de pellet in 1 ml gereduceerd serummedium (zie tabel van materialen ). Tel het aantal cellen met een kamer van Bürker en gebruik minimaal 1 x 10 5 cellen per elektroporatie-reactie. Voeg 9 ml gereduceerd serummedium toe aan de 15 ml buis en centrifuge bij kamertemperatuur, 3 min bij 400 x g. elektroporatie OPMERKING: In de volgende secties worden instructies gegeven over het uitvoeren van elektroporatie en organoïden te herstellen. Verwijder al het supernatant en resuspendeer de pellet in een elektroporatie-oplossing (zie tabel van materialen ). Voeg een totale hoeveelheid 10 μg DNA toe aan de celsuspensie en voeg elektroporatieoplossing toe aan een eindvolume van 100 μl en houd de cel-DNEen mengsel op ijs. Gebruik CRISPR-concatamer-vectoren in combinatie met een Cas9-expressieplasmide ( bijv. Addgen # 41815) in een verhouding van 1: 1. OPMERKING: Het totale volume van het toegevoegd DNA moet minder dan of gelijk zijn aan 10% van het totale reactievolume. Inclusief een aparte transfectiemengsel die een GFP-plasmide bevat om transfectie-efficiëntie te evalueren ( bijv . PCMV-GFP, Addgen # 11153 of een ander generisch GFP-expressieplasmide). Voeg het cel-DNA-mengsel toe aan de elektroporatie-cuvette en plaats het in de elektroporatorkamer. Meet de impedantie door op de juiste knop op de elektroporator te drukken en ervoor te zorgen dat het 0,030-0,055 Ω is. Voer elektroporatie uit volgens de instellingen in tabel 3 . OPMERKING: als de impedantiewaarde buiten het toegestane bereik valt, moet u het volume van de oplossing in de cuvette aanpassen. Voeg 400 μL elektroporatiebuffer + Y-27632 toe aan de cuvette en laat deze vervolgens overbrengen naar een 1,5 ml buis. IncubaTe bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om cellen te laten herstellen en vervolgens gedurende 3 minuten op kamertemperatuur te draaien bij 400 x g. Verwijder de supernatant en resusteer de pellet in 20 μL / putje van de keldermatrix. Zaai ongeveer 1 x 10 4 tot 1 x 10 5 cellen per putje in een 48-putjesplaat en voeg EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v / v DMSO-medium toe. Incubeer bij 37 ° C. Op dag 5, verander het medium naar EN + CHIR99021 + Y-27632, en controleer transfectie-efficiëntie door GFP-expressie te waarnemen ( Figuur 2 ). Houd organoïden bij 37 ° C en ververs EN + CHIR99021 + Y-27632 medium na 2 dagen. Op dag 9, verander het medium naar WENR + Nic + Y-27632 en incubeer bij 37 ° C. OPMERKING: Y-27632 kan na 7-10 dagen verwijderd worden (op dag 16-19). Poring puls </strong> Transferpuls Spanning 175V 20V Pulslengte 5 ms 50 msec Pulse interval 50 msec 50 msec Aantal pulsen 2 5 Decay rate 10% 40% Polariteit + +/- Tabel 3: Elektroporatie instellingen. 4. Groei Factor Intrekking Opmerking: Hier wordt een voorbeeld gegeven van het uitvoeren van een groeifactor-terugtrekkingsexperiment bij het uitschakelen van negatieve regulatoren van de Wnt-weg in darmorganoïden. 10-14 dagen avteR elektroporatie, verdeel de organoïden in een 1: 3 verhouding in een 48-putjesplaat volgens de bovenstaande stappen (3.2.1 – 3.2.2). Resuspendeer de organoidpellet in 20 μl basementmembraanmatrix en laat het gedurende 10 minuten bij 37 ° C stollen. Vervolgens overlay 250 μL groeifactor-beroofd medium ( bijvoorbeeld EN) om te testen of knock-out van de doelgenen is bereikt 5 . Verdeel de organoïden onder groeifactor-beroofde omstandigheden voor een minimum van 2 – 3 passages om een ​​verschil in overleving te zien tussen wildtype (WT) controleorganoïden en mutante organoïden 5 , 15 . OPMERKING: Wildtype-organoïden mogen niet overleven in groeifactor-beroofd medium over twee passages, terwijl mutantlijnen kunnen groeien.