Ce protocole décrit les étapes pour le clonage de plusieurs ARN à guide unique dans un vecteur de vecteur de guide RNA, qui est particulièrement utilisé dans la création de knockouts multi-gènes utilisant la technologie CRISPR / Cas9. La génération de double knockouts dans les organoïdes intestinaux est une application possible de cette méthode.
La technologie CRISPR / Cas9 a considérablement amélioré la faisabilité et la rapidité des études de perte de fonction qui sont essentielles à la compréhension de la fonction génétique. Dans les eucaryotes supérieurs, les gènes paraloges peuvent masquer un phénotype potentiel en compensant la perte d'un gène, limitant ainsi l'information qui peut être obtenue à partir d'études génétiques s'appuyant sur des knockouts à un seul gène. Nous avons développé une nouvelle méthode de clonage rapide pour les concatéristes guides d'ARN (gRNA) afin de créer des knock-out multi-gènes après un seul tour de transfection dans les organoïdes intestinales de souris. Notre stratégie permet la concatérisation de jusqu'à quatre gRNAs individuels en un seul vecteur en effectuant une seule réaction de mélange de Golden Gate avec des oligos de gARN recuits et un vecteur rétroviral pré-conçu. Cela permet soit le knockout simultané de jusqu'à quatre gènes différents, soit une augmentation de l'efficacité du knock-out suite au ciblage d'un gène par plusieurs gRNA. Dans ce protocole, nous montrons en détailComment cloner efficacement plusieurs gRNAs dans le vecteur CRCIR-concatemer rétroviral et comment obtenir une électroporation hautement efficace dans les organoïdes intestinaux. À titre d'exemple, nous montrons que le knock-out simultané de deux paires de gènes codant pour les régulateurs négatifs de la voie de signalisation Wnt (Axin1 / 2 et Rnf43 / Znrf3) rend les organoïdes intestinaux résistants au retrait des facteurs de croissance clés.
L'approche génétique inverse est une méthode largement utilisée pour étudier la fonction d'un gène. En particulier, les études de perte de fonction, dans lesquelles la perturbation d'un gène provoque des altérations phénotypiques, jouent un rôle clé dans la compréhension des processus biologiques. La méthode CRISPR / Cas9 représente l'avancement le plus récent de la technologie d'ingénierie du génome et a révolutionné la pratique actuelle de la génétique dans les cellules et les organismes. Cas9 est une endonucléase guidée par un ARN qui se lie à une séquence d'ADN spécifique complémentaire à l'ARNg et génère une rupture à double brin (DSB). Cette DSB recrute des machines de réparation de l'ADN qui, en l'absence d'un modèle d'ADN pour la recombinaison homologue, re-ligateront le fil d'ADN coupé via une jointure terminale non homologue propice aux erreurs, ce qui peut ainsi entraîner des insertions ou des deletions de nucléotide (s) Provoquant des mutations de décalage de cadre 1 .
La grande facilité et la polyvalence de l'accord CRISPR / Cas9Oach l'a fait un outil très attrayant pour les écrans knock-out à l'échelle du génome visant à démêler les fonctions génétiques inconnues 2 , 3 . Néanmoins, les approches de knock-out à un seul gène sont limitées si des paralogues multiples avec des fonctions redondantes existent. Ainsi, l'ablation d'un seul gène pourrait ne pas être suffisant pour déterminer la fonction de ce gène étant donné une compensation possible par des paralogues, ce qui entraîne peu ou pas d'altération phénotypique 4 . Il est donc important d'éliminer les parallèles en parallèle en fournissant de multiples vecteurs d'ARNg ciblant les différents gènes paraloges afin de surmonter l'influence de la compensation génétique.
Pour étendre l'utilisation de CRISPR / Cas9 à un knockout de gène paralogé, nous avons développé récemment une méthode de clonage rapide et en une étape pour cloner jusqu'à quatre gRNAs pré-recuits dans un seul vecteur rétroviral 5 . L'épine dorsale, nommée CRISPR-concatemer, est baséeSur un plasmide rétroviral MSCV contenant des cassettes d'expression de gARN répétitives. Chaque cassette contient deux sites de reconnaissance inversés de l'enzyme de restriction Type IIS Bbs I, qui peut être remplacée irréversiblement par un oligo à l'ARNp recuit avec des surplombs correspondants à l'aide d'une réaction de brassage Golden Gate dans un seul tube 6 . Cette méthode de clonage consiste en des cycles répétitifs de digestion et de ligature qui permettent l'assemblage simultané de multiples fragments d'ADN en exploitant les différentes séquences de surtension générées par Bbs I. L'unicité de cette enzyme est, par exemple, la capacité d'effectuer des coupures asymétriques en dehors de sa reconnaissance séquence; Par conséquent, chaque cassette peut avoir une séquence différente avec des surplombs personnalisés flanquant le site central de Bbs I et de cette manière, chaque gRNA peut être clone dans une position spécifique et une orientation du vecteur concatemer.
En tant que preuve de principe, nous avons démontré l'utilisation de cette stratégie dansOrganoïdes intestinaux de souris en perturbant simultanément deux paires de régulateurs négatifs paraloges de la voie de Wnt par un cycle d'électroporation 5 .
Au cours des dernières années, de nombreux autres groupes ont développé des stratégies similaires basées sur de multiples vecteurs d'expression d'ARNg construits en utilisant Golden Gate shuffling 7 pour réaliser des gènes multi-gènes dans différents systèmes modèles, tels que les lignées cellulaires humaines 8 , 9 , le poisson zèbre 10 et Escherichia coli 11 . Dans leurs protocoles, les gRNA sont d'abord clones dans des vecteurs intermédiaires individuels puis assemblés ensemble en un produit final. En revanche, le principal avantage de notre stratégie CRISPR-concatemer est la commodité d'une seule étape de clonage Bbs I. Comme d'autres concatères gRNA, notre méthode rend possible soit le knock-out simultané jusqu'à quatreDifférents gènes ou une augmentation de l'efficacité du knock-out de CRISPR suite au ciblage d'un ou deux gènes avec des ARNm multiples ( figure 1 ).
Dans ce protocole, nous décrivons en détail toutes les étapes de la génération de vecteurs CRISPR-concatemer, du design gRNA à la réaction Golden Gate et à la confirmation du clonage réussi. Nous fournissons également un protocole hautement efficace pour la transfection de CRISPR-concatemers dans des organoïdes intestinaux de souris par électroporation et des expériences ultérieures de retrait de facteur de croissance.
Dans ce protocole, nous détaillons toutes les étapes nécessaires pour générer CRISPR-concatemers et pour appliquer CRISPR-concatemers dans les organoïdes intestinaux de souris afin d'éliminer simultanément plusieurs gènes. Comme indiqué précédemment, cette stratégie présente plusieurs avantages, tels que sa vitesse, son efficacité élevée et sa rentabilité.
Afin d'effectuer avec succès toute la procédure, il y a quelques aspects critiques à considérer. Tout d'abord, il est essentiel que tous les oligos d'ARNp soient correctement recuits et phosphorylés, car ils représentent le matériau de départ pour la réaction de clonage Bbs I qui en soi est très efficace. Deuxièmement, lorsque les organoïdes électroporiques, plus les cellules sont utilisées par condition, plus l'efficacité de transfection maximale possible est élevée. En outre, il est également important qu'après la dissociation cellulaire, les grappes de petites cellules prédominent sur des cellules individuelles.
Néanmoins, il est possible de rencontrer des problèmes techniquesLorsque vous tentez le clonage ou la transfection pour la première fois; Dans le cas de problèmes lors du clonage de l'ARNg, il est recommandé de vérifier la séquence d'oligo-gRNA et, s'il y a lieu, sélectionner des colonies bactériennes supplémentaires pour le dépistage de la digestion par restriction. Si l'efficacité de la transfection et la viabilité cellulaire sont peu post-électroporation, il est conseillé de répéter le protocole en utilisant plus de cellules par état et en réduisant le temps de dissociation cellulaire à 3 min.
Bien que la génération de CRISPR-concatemers soit relativement peu coûteuse et facile, l'exécution d'écrans génétiques à plus grande échelle dans les organoïdes n'est pas, car l'échelle est limitée par les coûts associés à la culture organoïde et par sa nature à forte intensité de main-d'œuvre. Il convient de mentionner dans ce cas que la méthode CRISPR-concatemer est également compatible avec les lignées cellulaires, telles que le HEK293 et les cellules souches embryonnaires de souris.
Indépendamment du système cellulaire, un autre inconvénient potentiel de cette sTrategy peut être rencontré en visant le knock-out simultané de trois ou quatre gènes différents. Par exemple, chaque gRNA aura une efficacité de ciblage différente et les changements de toucher tous les gènes au même moment peuvent être relativement faibles; Pour cette raison, il est conseillé d'utiliser le système concatemer pour diriger plus d'un gRNA contre le même gène.
D'autres stratégies, basées sur le brassage de Golden Gate, ont été proposées au cours des années pour générer des vecteurs d'ADNg multiplex 7 , 8 . Cependant, dans notre méthode, il est possible d'assembler directement plusieurs ARNg dans un seul vecteur rétroviral dans un seul cycle de clonage, ce qui le rend approprié pour générer des bibliothèques de gRNA pour cibler des paralogues.
Notre CRISPR-concatemer est construit dans le squelette du vecteur retroviral MSCV. Ainsi, le retrovirus contenant du concatéron de gRNA peut être utilisé pour générer des lignées cellulaires stables qui s'explosentRessemble à des gRNA. Lorsqu'il est combiné avec un système Cas9 inducible, on peut effectuer des knock-out parallèles inductibles à l'aide de notre système.
En résumé, nous décrivons ici comment cloner jusqu'à quatre gRNAs différents dans le même vecteur en une étape et comment appliquer cette stratégie à une culture organoïde avec une efficacité de transfection élevée. En outre, nous fournissons des suggestions utiles pour maximiser les chances de succès tout au long de la procédure.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Christopher Hindley pour la lecture critique du manuscrit. AM est pris en charge par Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R. Est soutenu par le Medical Research Council (MRC), et BK.K. Et RM sont soutenus par une bourse Sir Henry Dale de Wellcome Trust et la Royal Society [101241 / Z / 13 / Z] et reçoivent un soutien grâce à une subvention de base de Wellcome Trust et MRC au Wellcome Trust – MRC Cambridge Stem Cell Institute .
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |