يصف هذا البروتوكول خطوات لاستنساخ متعددة رنا دليل واحد في دليل واحد ناقلات الحمض النووي الريبي المتجهات، والتي هي ذات فائدة خاصة في خلق ضربات قاضية متعددة الجينات باستخدام تقنية كريسبر / Cas9. ويظهر توليد ضربات قاضية مزدوجة في أورغانويدز الأمعاء باعتبارها تطبيق محتمل لهذه الطريقة.
وقد تحسنت التكنولوجيا كريسبر / Cas9 إلى حد كبير جدوى وسرعة الدراسات فقدان وظيفة التي هي أساسية في فهم وظيفة الجينات. في حقيقيات حقيقيات أعلى، يمكن للجينات بارالوغوس أن تخفي النمط الظاهري المحتمل عن طريق تعويض فقدان الجين، مما يحد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من الدراسات الجينية التي تعتمد على الجينات المفردة الجينية واحدة. قمنا بتطوير رواية، طريقة الاستنساخ السريع لالمرنا الحمض النووي الريبي (غرنا) كونكاتيمرز من أجل خلق متعددة الجينات خروج المغلوب بعد جولة واحدة من ترنسفكأيشن في الماوس أورغانويدس الأمعاء الصغيرة. استراتيجيتنا تسمح ل كونكاتيمريزاتيون تصل إلى أربعة غرناس الفردية في ناقلات واحدة عن طريق إجراء واحد غولدن غيت خلط رد فعل مع أوليغوس الحمض الريبي النووي الذواب صلب وناقلات ريتروفيرال مصممة مسبقا. وهذا يسمح إما خروج المغلوب في وقت واحد لمدة تصل إلى أربعة جينات مختلفة، أو زيادة كفاءة خروج المغلوب بعد استهداف الجين واحد من قبل غرناز متعددة. في هذا البروتوكول، نعرض بالتفصيلكيفية استنساخ بكفاءة متعددة غرناس في ناقل الفيروس كريسبر-كونكاتيمر ريتروفيرال وكيفية تحقيق إليكتروبوراتيون كفاءة عالية في أورغانويدز المعوية. على سبيل المثال، نبين أن خروج المغلوب في وقت واحد من اثنين من أزواج من الجينات ترميز المنظمين السلبي من مسار الإشارات ونت (Axin1 / 2 و Rnf43 / Znrf3) يجعل أورغانويدات الأمعاء مقاومة لانسحاب عوامل النمو الرئيسية.
نهج الوراثة العكسي هو طريقة تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في وظيفة الجين. على وجه الخصوص، وفقدان وظيفة الدالات، حيث ان تعطيل الجينات يسبب التغيرات المظهرية، تلعب دورا رئيسيا في بناء فهمنا للعمليات البيولوجية. تمثل الطريقة كريسبر / Cas9 أحدث التطورات في تكنولوجيا هندسة الجينوم، وقد أحدثت ثورة في الممارسة الحالية لعلم الوراثة في الخلايا والكائنات الحية. Cas9 هو إندوكلياز الموجهة من الحمض النووي الريبي الذي يربط تسلسل الحمض النووي محددة مكملة ل غرنا ويولد كسر مزدوج حبلا (دسب). هذا دسب المجندين آلات إصلاح الحمض النووي أنه في غياب قالب الحمض النووي لإعادة التركيب مثلي، وإعادة ليغات حبلا الحمض النووي خفض عن طريق الخطأ المعرضة غير متماثلة نهاية الانضمام، والتي يمكن أن تؤدي بالتالي إلى إدراج أو حذف النوكليوتيدات (ق) مما تسبب الطفرات فرمشيفت 1 .
سهولة كبيرة وبراعة من كريسبر / Cas9 أبرأوتش جعلت أداة جذابة للغاية لشاشات خروج المغلوب الجينوم على نطاق واسع تهدف إلى كشف وظائف الجينات غير معروف 2 ، 3 . ومع ذلك، فإن نهج خروج المغلوب الجيني واحد من استخدام محدود إذا بارالوغس متعددة مع وجود وظائف زائدة عن الحاجة. وهكذا، قد لا يكون تخثر جين واحد كافيا لتحديد وظيفة هذا الجين نظرا لتعويض ممكن من قبل بارالوغوز مما أدى إلى القليل أو عدم وجود تغيير المظهري 4 . ولذلك فمن المهم أن تدق المعادلات بالتوازي من خلال تقديم ناقلات الحمض النووي الريبي متعددة تستهدف مختلف الجينات بارالوغوس من أجل التغلب على تأثير التعويض الجيني.
لتوسيع استخدام كريسبر / Cas9 إلى خروج المغلوب الجيني خوارزمية، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة استنساخ سريعة، من خطوة واحدة لاستنساخ ما يصل إلى أربعة غرناس قبل صلب إلى ناقلات الفيروس الوعائي واحد 5 . العمود الفقري، واسمه كريسبر-كونكاتيمر، ويستندعلى البلازميد مسف ريتروفيرال تحتوي على تكرار غرنا أشرطة الكاسيت. كل كاسيت يحتوي على اثنين من مواقع الاعتراف مقلوب من نوع إيس انزيم تقييد بس الأول، والتي يمكن استبدالها بشكل لا رجعة فيه من قبل غرنا صلب أوليغو مع المتراكمة مطابقة باستخدام غولدن غيت خلط خلط رد فعل في أنبوب واحد 6 . وتتكون طريقة الاستنساخ هذه من دورات متكررة من الهضم والربط التي تسمح بالتجمع المتزامن لشظايا الحمض النووي المتعددة من خلال استغلال تسلسل متراكمة مختلفة ولدت من قبل بس I. تفرد هذا الإنزيم هو، على سبيل المثال، القدرة على إجراء تخفيضات غير المتماثلة خارج الاعتراف بها تسلسل؛ وبالتالي، يمكن لكل كاسيت يكون تسلسل مختلف مع يتدلى مخصصة المرافقة الموقع الأساسية BBS الأول وبهذه الطريقة، كل gRNA يمكن استنساخ في وضع واتجاه محدد من ناقلات متسلسل.
وكدليل على المبدأ، أثبتنا استخدام هذه الاستراتيجية فيالماوس أورغانويدز المعوية عن طريق تعطيل في وقت واحد اثنين من أزواج من المنظمين السلبية بارالوغوس من مسار ونت من قبل جولة واحدة من إليكتروبوراتيون 5 .
خلال السنوات القليلة الماضية، وضعت العديد من المجموعات الأخرى استراتيجيات مماثلة على أساس متعددة ناقلات التعبير الحمض النووي الريبي التي شيدت باستخدام البوابة الذهبية خلط 7 لتحقيق خروج المغلوب متعددة الجينات في أنظمة نموذجية مختلفة، مثل خطوط الخلايا البشرية 8 ، 9 ، الزرد 10 والإشريكية القولونية 11 – في البروتوكولات الخاصة بهم، يتم استنساخ غرناس أولا في ناقلات وسيطة الفردية ومن ثم تجميعها معا في منتج نهائي واحد. على النقيض من ذلك، فإن الميزة الرئيسية لاستراتيجيتنا كريسبر-كونكاتيمر هو راحة واحدة بس الأول خلط، خطوة الاستنساخ. مثل غيرها من المراسلات غرنا، طريقة لدينا يجعل ممكنا إما خروج المغلوب في وقت واحد لمدة تصل إلى أربعةوجينات مختلفة أو زيادة كريسر خروج المغلوب كفاءة بعد استهداف واحد أو اثنين من الجينات مع غرناس متعددة ( الشكل 1 ).
في هذا البروتوكول، ونحن تصف بالتفصيل كل خطوة في توليد ناقلات كريسبر-كونكاتيمر، من تصميم غرنا إلى رد فعل غولدن غيت وتأكيد الاستنساخ الناجح. ونحن نقدم أيضا بروتوكول كفاءة عالية لترنسفكأيشن من كريسبر-كونكاتيمرز في الماوس أورغانويدس الأمعاء الصغيرة عن طريق إليكتروبوراتيون والتجارب انسحاب عامل النمو اللاحق.
في هذا البروتوكول، ونحن بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوليد كريسبر-كونكاتيمرز وتطبيق كريسبر-كونكاتيمرز في أورغانويدس الأمعاء الماوس من أجل ضرب في وقت واحد من جينات متعددة. وكما ذكر سابقا، فإن لهذه الاستراتيجية عدة مزايا، مثل سرعتها وكفاءتها العالية وفعاليتها من حيث التكلفة.
من أجل تنفيذ الإجراء بأكمله بنجاح، وهناك عدد قليل من الجوانب الهامة للنظر فيها. أولا، من الضروري أن جميع أوليغوس الحمض الريبي النووي النقال هي صلبة بشكل صحيح وفوسفهوريلاتد، لأنها تمثل المواد انطلاق لاستنساخ بس الأول استنساخ أنه في حد ذاته هو فعال جدا. ثانيا، عندما إليكتروبوراتينغ أورغانويدز، والمزيد من الخلايا المستخدمة في حالة، وارتفاع كفاءة ترنسفكأيشن أقصى قدر ممكن. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أيضا أنه بعد تفكك الخلية، وتغلب مجموعات الخلايا الصغيرة على خلايا واحدة.
ومع ذلك، فمن الممكن أن تواجه المهنيةيمس عند محاولة إما الاستنساخ أو ترنسفكأيشن للمرة الأولى. في حالة وجود مشاكل أثناء الاستنساخ غرنا، فمن المستحسن لمضاعفة التحقق من تسلسل أولي غرنا، وإذا كان ذلك صحيحا، حدد المستعمرات البكتيرية إضافية للفحص تقييد الهضم. إذا كفاءة ترنسفكأيشن وبقاء الخلية منخفضة بعد إليكتروبوراتيون، ثم فإنه من المستحسن لتكرار بروتوكول باستخدام المزيد من الخلايا في حالة والحد من الوقت من تفكك الخلية إلى 3 دقائق.
على الرغم من أن توليد كريسبر-كونكاتيمرز هو رخيصة نسبيا وسهلة، وأداء شاشات وراثية أكبر نطاقا في أورغانويدس ليس، كما هو مقيد من حيث التكاليف المرتبطة الثقافة العضوية وطبيعة كثيفة العمالة. ومن الجدير بالذكر في هذه الحالة أن طريقة كريسبر-كونكاتيمر هي أيضا متوافقة مع خطوط الخلايا، مثل HEK293 والخلايا الجذعية الجنينية الماوس.
بغض النظر عن النظام الخلوي، عيب محتمل آخر من هذا sتراجي يمكن أن تصادف عندما تهدف إلى خروج المغلوب في وقت واحد من ثلاثة أو أربعة جينات مختلفة. على سبيل المثال، سيكون لكل غرنا كفاءة استهداف مختلفة، والتغيرات في ضرب جميع الجينات في نفس الوقت يمكن أن تكون منخفضة نسبيا، لهذا السبب، فإنه من المستحسن لتوظيف نظام كونكاتيمر لتوجيه أكثر من غرنا واحد ضد نفس الجين.
وقد اقترحت استراتيجيات بديلة على أساس مماثل على غولدن غيت خلط على مر السنين لتوليد ناقلات الحمض الريبي النووي النقال متعددة 7 ، 8 . ومع ذلك، في طريقة لدينا فمن الممكن لتجميع مباشرة غرناس متعددة في ناقلات فيروسات واحدة في جولة واحدة من الاستنساخ، مما يجعلها مناسبة لتوليد المكتبات غرنا لاستهداف المعادلات.
لدينا كريسبر-كونكاتيمر بنيت في مسكف العمود الفقري ناقلات الفيروس العكسي. وهكذا، يمكن أن تستخدم الحمض النووي الريبي التي تحتوي على الموروث الفيروسي لتوليد خطوط الخلايا مستقرة أن أوفيركسريس غرناس. عندما يقترن نظام Cas9 محرض، يمكن للمرء أن يؤدي محرضات قاضات المحاكاة باستخدام نظامنا.
باختصار، هنا نحن تصف كيفية استنساخ ما يصل إلى أربعة غرناس مختلفة في نفس ناقلات في خطوة واحدة وكيفية تطبيق هذه الاستراتيجية لثقافة عضوي مع كفاءة ترنسفكأيشن عالية. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم اقتراحات مفيدة لتحقيق أقصى قدر من فرص النجاح في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.
The authors have nothing to disclose.
نشكر كريستوفر هيندلي على القراءة الحرجة للمخطوطة. آم مدعوم من ونتساب (ماري كوري إتن)، آ-R. بدعم من مجلس البحوث الطبية (مرك)، و بك. و آرإم بدعم من زمالة السير هنري ديل من ويلكوم ترست والجمعية الملكية [101241 / Z / 13 / Z] والحصول على الدعم من خلال منحة أساسية من ويلكوم ترست ومركز موارد المهاجرين إلى ويلكوم الثقة – مرك كامبريدج الخلايا الجذعية معهد .
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |