Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize
Summary
Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.
Abstract
MRNA çeviri düzenleyen mekanizmalar mikrop çizgi geliştirme, hücre farklılaşma ve organogenesis, gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra birden çok hastalıklar söz konusu. Çok sayıda yayın inandırıcı belirli mekanizmaları sıkıca mRNA çeviri düzenleyici göstermiştir. Çeviri kaynaklı protein ifade Yönetmeliği artan ilgi çalışma ve de novo protein sentezi cellulo içindetakip roman yöntemleri gelişmesine neden olmuştur. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı yapım onları ve kez okudu olabilir mRNA hedef sayısını sınırlama, karmaşıktır. Bu makale yalnızca temel reaktifler ve ölçmek ve herhangi bir hücre satırında çeşitli koşullarda oluşan değişiklikleri mRNA çeviri görselleştirmek için bir confocal floresan görüntüleme sistemi gerektirir bir yöntem öneriyor. Bu yöntem son zamanlarda zaman böylece biyolojik çeşitli sırasında kısa bir süre için de novo çeviri görselleştirme imkanı sunan, kısa bir süre içinde yapışık hücreleri hücre altı yapıları yerelleştirilmiş çevirisini göstermek için kullanılan işlemler veya değişiklik translasyonel faaliyet belirli uyaranlara yanıt olarak doğrulanması.
Introduction
Farklı hücresel işlevler tarafından çeviri Yönetmeliği yeni araçlar ve mRNA çeviri ve düzenlenmiş protein sentezi1,2 hücre altı lokalizasyonu belirlemek için yöntemler geliştirmek için birçok araştırma ekipleri yol açtı ,3,4. Bu son teknolojik gelişmeleri içeren çeviri upregulation veya belirli mRNA’ların baskı nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz5 gibi biyolojik süreçler sırasında mekanizmaları gelişmiş bir anlayış için izin ver ,6,7,8. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı veya tehlikeli Kimyasalları ve çoğu laboratuvarları kullanılabilir olmayabilir belirli donanımları gerektirir. Bu nedenle, özellikle bu olası sorunları aşmak için çeviri olaylar hızlı değerlendirmesi için izin vermek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem belirli hücresel süreçler sırasında ortaya çıkan akut translasyonel modülasyon algılar ve ayrıca confocal mikroskobu kullanarak Çeviri Yerelleştirme için sağlar.
Yöntem tanımlamak burada yerelleştirilmiş çeviri Yayilim başlatma merkezleri (SIC)5denilen hücre altı bölmeleri içinde izlemek için kullanılmıştır. SICs yeni doğmakta olan yapışma kompleksleri üzerine yerelleştirilmiş numaralı seribaşı hücrelerde bulunan geçici yapılar vardır. SICs ve yapışma kompleksler farklı olmakla birlikte, onların kaderi yakından bağlantılıdır. Gerçekten de, SICs giderek odak yapışma karmaşık olgunlaşma bir yapışma siteye yapışma başlangıç aşamasında ortadan olduğu bilinmektedir. Bulduk RNA bağlanıcı proteinler özellikle mRNA çeviri (Örneğin, Sam68, FMRP ve G3BP1) kontrol etmek için bilinen ve RNA’ların bunlar içinde zenginleştirilmiş poliadenile yapıları5. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, SIC ilişkili mRNA çeviri bir denetim noktası olanak verecek şekilde davranır düzenlenmesi hücre adezyon birleştirilecek hücreler seribaşı gösterdi. Bu yöntemi, puromisindir birleşme göre yüzey çeviri tahlil (SunSET) algılama adapte bir sürüm düşünülebilir. Aslında sigara radioactively etiketli bir amino asit kullanarak küresel protein sentezi oranları ölçmek için geliştirilmiş, protein puromycilation de novo protein sentezi9görselleştirmek için etkili bir yol sunar. Bu yöntem puromisindir, çeviri erken zinciri fesih ribozom10üzerinden engeller bir antibiyotik iç davranışını kullanır. Gerçekten de, puromisindir yapısal olarak tyrosyl-tRNA, peptid zincirleri bir peptit bağı oluşumu ile elongating içine şirketler için sağlar benzerdir. Ancak, puromisindir bağlama büyüyen bir peptit zincirine yeni bir peptit bağı puromisindir tRNA içinde bulunan hydrolysable ester bağı yerine hydrolysable Amid bağı olduğundan sonraki aminoasil tRNA ile oluşturulmaktadır engeller. Böylece, erken sürümü ile aktif olarak çevrilmiş mRNA9,11‘ e,12 karşılık gelen çok sayıda kesilmiş puromycilated polipeptitler polipeptitler elongating içine puromisindir birleşmesiyle sonuçları .
Bu yöntemi kullanarak, kısa sürede dul içinde aktif çeviri değerlendirmek mümkün (Örneğin, 5 min) hücresel yapışma antibiyotik ile 5 dk süre takviye hücrelerde puromisindir karşı spesifik bir antikor kullanarak sırasında hücre adezyon sırasında farklı zaman noktalarda5işlem. Çok özel antikorlar karşı puromycilated yan yönettiği bu tahlil duyarlığını güvenmektedir. Puromycilated polipeptid immünfloresan tespiti de confocal görüntüleme sistemleri kullanarak büyük bir hassasiyetle sayısal yeni çevrilmiş mRNA genel hücre altı yeniden bölümlenir sağlar.
Bu nedenle, bu yöntem çok sayıda translasyonel düzenleyici mekanizmaları nöronal granülasyon6,13,14, gibi süreçleri dahil eğitim laboratuvarları için ilgili bir seçenek sunar 15, morphogen mRNA Yerelleştirme ve çeviri sırasında geliştirme16,17. Ayrıca hızlı biyolojik olaylarda, hücre göç, yapışma veya işgal gibi veya sadece translasyonel değişiklikleri5, neden ilaç tedavileri değerlendirmek için yerelleştirilmiş veya bölümlere çeviri eğitimi için de uygun olduğu 7 , 18. genel olarak, bu yöntem, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir şekilde yerelleştirilmiş veya kontrollü çeviri olaylar görselleştirme için sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son teknolojik gelişmeler mekanizmaları translasyonel upregulation ilgili daha iyi bir anlayış ya da nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz gibi biyolojik süreçleri içinde belirli mRNA’ların baskı için izin vermiş. Burada açıklanan düşük maliyetli metodoloji nasıl RNA bağlanıcı proteinler hücre adezyon, geçiş ve işgali gibi metastatik işlemleri düzenleyen çalışma hücrelerdeki görüntülenmeyecektir çeviri olayları sağlar.
De novo pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Hücre görüntüleme birimi teknik yardım için araştırma merkezinin teşekkür ediyoruz. M.-É. Huot olan bir Junior 1 araştırma bilim adamı Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Bu eser Kanada kurumları, Sağlık (sayı CIHR, paspas-286437 M.-É için hibe. araştırma tarafından desteklenmiştir Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
