Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

La régulation de la traduction par différentes fonctions cellulaires a incité de nombreuses équipes de recherche pour développer de nouveaux outils et méthodes pour déterminer la localisation subcellulaire de traduction de l’ARNm et de protéines réglementé synthèse^{1,2 ,3,4}. Ces progrès technologiques récents permettent une meilleure compréhension des mécanismes impliquant upregulation de traduction ou de la répression des ARNm spécifiques au cours de processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase^{5 ,6,7,8}. Cependant, la plupart de ces méthodes nécessite des réactifs coûteux ou dangereuses et des équipements spécifiques qui ne sont peut-être pas disponibles pour la plupart des laboratoires. À ce titre, il a développé une méthode rentable pour permettre l’évaluation rapide des événements de traduction pour précisément à contourner ces problèmes potentiels. Cette méthode détecte des modulations translationnelles aiguës qui se produisent au cours de processus cellulaires spécifiques et permet également la localisation de la traduction à l’aide de la microscopie confocale.

Les méthodes décrites ici ont été utilisés pour surveiller une traduction localisée dans les compartiments subcellulaires appelé épandage initiation centres (SIC)⁵. SICs sont transitoires structures trouvées dans les cellules ensemencées sont localisés sur le dessus de complexes d’adhérence naissante. Bien que SIC et complexes d’adhérence sont distinctes, leurs destins sont étroitement liés. En effet, SICs sont connus pour disparaître progressivement après maturation complexe adhérence focale dans un site d’adhésion au cours de la phase initiale de l’adhérence. Nous avons constaté que les protéines de liaison à l’ARN connues pour contrôler plus précisément traduction ARNm (p. ex., Sam68, FMRP et G3BP1) et polyadénylé RNAs sont enrichis au sein de ces structures⁵. En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la régulation de l’ARNm associés à SIC traduction agit comme un point de contrôle permettant ensemencé les cellules afin de consolider l’adhésion cellulaire. Cette méthode basée sur l’incorporation de la puromycine, pourrait être considérée une version adaptée de la détection de surface d’essai de traduction (coucher du soleil). Développé à l’origine pour mesurer les taux de synthèse protéique globale à l’aide d’un acide aminé non-radioactivement marqué, protéine puromycilation offre un moyen efficace pour visualiser de la synthèse protéique de novo ⁹. Cette méthode repose sur le comportement intrinsèque de la puromycine, un antibiotique qui bloque la traduction via la terminaison de la chaîne prématurée dans le ribosome¹⁰. En effet, la puromycine est structurellement analogue aux tyrosyl-tRNA, qui permet de l’incorporer dans allongeant chaînes peptidiques via la formation d’une liaison peptidique. Cependant, liaison de puromycine à une chaîne peptidique croissante empêche une nouvelle liaison peptidique se forment avec la prochain aminoacyl-tRNA, puisque la puromycine a une liaison amide non hydrolysables au lieu de la liaison ester hydrolysables dans l’ARNt. Ainsi, l’incorporation de puromycine allongeant polypeptides se traduit par la sortie prématurée de nombreux polypeptides puromycilated tronqué correspondant à activement traduction ARNm^9,11,12 .

En utilisant cette méthode, il était possible d’évaluer la traduction au sein d’une veuve de peu de temps (par exemple, 5 min) au cours de l’adhésion cellulaire à l’aide d’un anticorps spécifique contre la puromycine sur les cellules qui ont été complétées par l’antibiotique pendant 5 min à différents moments au cours de l’adhésion cellulaire traiter⁵. La précision de ce test s’appuie sur les anticorps hautement spécifiques dirigés contre la portion puromycilated. Détection par immunofluorescence du polypeptide puromycilated fournit une répartition subcellulaire générale de l’ARNm nouvellement traduit, qui peut aussi être évalués avec une grande précision à l’aide de systèmes d’imagerie confocale.

Par conséquent, cette méthode offre une option pertinente pour un grand nombre de laboratoires d’étude des mécanismes de réglementation translationnelles impliqués dans des processus tels que la granulation neuronale^{6,13,14, 15}, localisation d’ARNm autocatalytiques et traduction au cours du développement^16,17. Il est aussi bien adapté à l’étude de traduction localisée ou compartimentée au cours rapides événements biologiques, tels que la migration cellulaire, adhérence ou invasion, ou simplement évaluer les traitements médicamenteux qui pourraient induire des changements translationnelle^{5, 7 , 18}. dans l’ensemble, cette méthode permet la visualisation des événements de traduction localisée ou contrôlé d’une manière rapide, précise et rentable.