La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

La regulación de la traducción de diversas funciones celulares ha llevado a muchos equipos de investigación para desarrollar nuevas herramientas y métodos para determinar la localización subcelular de la traducción del mRNA y proteína regulada síntesis^{1,2 ,3,4}. Estos avances tecnológicos recientes permiten una mejor comprensión de los mecanismos que implican el upregulation de la traducción o la represión de los mRNAs específicos durante los procesos biológicos, como el desarrollo neuronal, la respuesta de la droga y metástasis^{5 ,6,7,8}. Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren reactivos caros o peligrosos y equipamiento específico que podría no estar disponible para la mayoría de los laboratorios. Como tal, fue desarrollado un método rentable para permitir la evaluación rápida de los eventos de traducción para específicamente evitar estos posibles problemas. Este método detecta agudas modulaciones traslacionales que se producen durante procesos celulares específicos y también permite la localización de la traducción usando microscopia confocal.

Se utilizaron los métodos descritos aquí para supervisar la traducción localizada dentro de compartimentos subcelulares llamado difusión de centros (SIC) de iniciación⁵. SICs son estructuras transitorias encontradas células sembradas que se localizan encima de los complejos de adhesión naciente. Aunque SICs y complejos de adhesión son distintos, sus destinos están íntimamente ligados. De hecho, SICs conocen a desaparecer poco a poco sobre maduración complejos de adhesión focal en un sitio de adherencia durante la fase inicial de adhesión. Hemos encontrado que las proteínas de unión de ARN conocidas para controlar específicamente la traducción del mRNA (p. ej., Sam68, FMRP y G3BP1) y cofia RNAs fueron enriquecidos dentro de estas estructuras⁵. Utilizando los métodos descritos aquí, demostramos que la regulación del mRNA SIC asociados traducción actúa como un punto de control que permite sembrar células para consolidar la adhesión celular. Este método, basado en la incorporación de puromicina, podría considerarse una versión adaptada de la detección superficial de prueba de traducción (SunSET). Originalmente desarrollado para medir las tasas de síntesis de proteína global utilizando un aminoácido marcado no radiactivo, proteína puromycilation ofrece una manera eficiente para visualizar de novo de síntesis de proteínas⁹. Este método se basa en el comportamiento intrínseco de puromicina, un antibiótico que bloquea la traducción a través de terminación prematura de la cadena en el ribosoma¹⁰. De hecho, la puromicina es estructuralmente análogo a Tirosil-ARNt, que permite la incorporación en alargar las cadenas de péptido a través de la formación de un enlace peptídico. Sin embargo, Unión de puromicina a una cadena creciente del peptide impide que un nuevo enlace peptídico formándose con el aminoacil-tRNA siguiente, puesto que la puromicina tiene un enlace de amida no hidrolizable en vez del enlace de éster hidrolizable en tRNAs. Así, la incorporación de puromicina alarga polipéptidos resulta en la liberación prematura de numerosos polipéptidos puromycilated truncada correspondiente a mRNA activamente traducido^9,11,12 .

Usando este método, fue posible evaluar la traducción activa dentro de una viuda de corto plazo (por ejemplo, 5 minutos) durante la adhesión celular usando un anticuerpo específico contra puromicina en células que fueron complementados con el antibiótico durante períodos de 5 minutos en diferentes momentos durante la adhesión celular proceso⁵. La precisión de este ensayo se basa en anticuerpos altamente específicos dirigidos contra la molécula de puromycilated. Detección inmunofluorescente del polipéptido puromycilated proporciona una distribución subcelular general del mRNA recién traducida, que también se puede cuantificar con gran precisión utilizando sistemas de proyección de imagen confocales.

Por lo tanto, este método ofrece una opción relevante para un gran número de laboratorios estudio traslacionales mecanismos implicados en procesos como la granulación neuronal^{6,13,14, 15}, morfogen mRNA, traducción y localización durante el desarrollo de^16,17. También es idóneo para estudiar traducción localizada o compartimentada durante rápidos acontecimientos biológicos, como la migración celular, adherencia o invasión, o simplemente evaluar los tratamientos con fármacos que pueden inducir cambios traslacional^{5, 7 , 18}. en general, este método permite la visualización de eventos de traducción localizada o controlados de una manera rápida, precisa y rentable.