Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

De regulering van de vertaling door verschillende cellulaire functies heeft ertoe geleid dat vele onderzoeksteams te ontwikkelen van nieuwe instrumenten en methoden voor de bepaling van de subcellular localisatie van mRNA vertaling en gereglementeerde eiwit synthese^{1,2 ,3,4}. Deze recente technologische vooruitgang zorgen voor een beter begrip van de mechanismen met betrekking tot vertaling opregulatie of de onderdrukking van specifieke mRNAs tijdens biologische processen, zoals de neuronale ontwikkeling, drug reactie en metastase^{5 ,6,7,8}. Echter, de meeste van deze methoden vereist duur of gevaarlijke reagentia en specifieke apparatuur die mogelijk niet beschikbaar voor de meeste laboratoria. Als zodanig, werd een voordelige methode te voorzien in de snelle evaluatie van vertaling gebeurtenissen ontwikkeld om deze potentiële problemen specifiek te omzeilen. Deze methode detecteert acute translationeel modulaties die zich tijdens specifieke cellulaire processen voordoen en voorziet ook in de lokalisatie van de vertaling met behulp van de confocal microscopie.

De hier beschreven methoden werden gebruikt om te controleren van gelokaliseerde vertaling binnen subcellular compartimenten genaamd verspreiden initiatie centra (SIC)⁵. SICs zijn tijdelijke structuren gevonden in geplaatste cellen, die zijn gelokaliseerd op de top van ontluikende hechting complexen. Hoewel SICs en hechting complexen onderscheiden worden, zijn hun lot nauw verbonden. Inderdaad, SICs is bekend dat het geleidelijk aan verdwijnen op focal hechting complexe rijping in een hechting site tijdens de eerste fase van de hechting. We vonden dat RNA-bindende proteïnen bekend om specifiek mRNA vertaling (b.v., Sam68, FMRP en G3BP1) en polyadenylated RNAs werden verrijkt binnen deze structuren⁵. Met behulp van de methoden beschreven hier toonden wij dat de regulering van SIC-geassocieerde mRNA vertaling als een controlepunt waardoor fungeert zaadjes cellen wilt samenvoegen cel adhesie. Deze methode, op basis van puromycin de opneming, kan worden overwogen een aangepaste versie van de oppervlakte sensing van vertaling assay (zonsondergang). Oorspronkelijk ontwikkeld voor het meten van globale eiwit synthese tarieven met behulp van een niet-radioactief gelabelde aminozuur, biedt eiwit puromycilation een efficiënte manier te visualiseren van DOVO eiwit synthese⁹. Deze methode is gebaseerd op de intrinsieke werking van puromycin, een antibioticum dat vertaling door voortijdige keten beëindiging in de ribosome^{10 blokkeert}. Inderdaad, puromycin is structureel analoog aan tyrosyl-tRNA, die voorziet in de opneming in het grondvlak van de peptide ketens via de vorming van een peptide-bond. Puromycin binding aan een groeiende peptide keten voorkomt echter dat een nieuwe peptide bond ontstaat met de volgende aminoacyl-tRNA, aangezien puromycin een niet-hydrolyseerbaar amide-binding in plaats van de hydrolyseerbaar ester-binding in tRNAs gevonden heeft. Dus, de opneming van puromycin in het grondvlak polypeptiden resulteert in de voortijdige vrijlating van talrijke afgeknotte puromycilated polypeptiden overeenkomt met actief vertaalde mRNA^9,11,12 .

Met behulp van deze methode, was het mogelijk om binnen een korte tijd weduwe actieve vertaling beoordelen (bijvoorbeeld 5 min) tijdens de cellulaire hechting met behulp van een specifiek antilichaam gericht tegen puromycin op cellen die werden aangevuld met het antibioticum voor periodes van 5-min verwerken op verschillende tijdstippen tijdens de cel adhesie⁵. De nauwkeurigheid van deze test is gebaseerd op zeer specifieke antilichamen gericht tegen de groep van de puromycilated. Immunefluorescentie detectie van de puromycilated-polypeptide biedt een algemene subcellular verdeling van de nieuwe vertaalde mRNA, die ook kan worden gekwantificeerd met grote nauwkeurigheid met behulp van de confocal imaging systemen.

Vandaar, deze methode biedt tevens een relevante optie voor een groot aantal laboratoria studeren translationeel regulerende mechanismen betrokken bij processen zoals neuronale granulatie^{6,13,14, 15}, morphogen mRNA lokalisatie en vertaling tijdens ontwikkeling^16,17. Het is ook zeer geschikt voor het bestuderen van gelokaliseerde of verzuilde vertaling tijdens snelle biologische gebeurtenissen, zoals cel migratie, hechting, of invasie, of gewoon beoordelen drug behandelingen die vertalende wijzigingen^5, induceren kunnen ^{7 , 18}. over het algemeen met deze methode kan voor de visualisatie van gelokaliseerde of gecontroleerde vertaling gebeurtenissen in een snelle, nauwkeurige en kosteneffectieve manier.