Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

Правила перевода различных клеточных функций побудило многие исследовательские группы для разработки новых инструментов и методов для определения субцеллюлярные локализации перевод мРНК и регулируемых белка синтез^{1,2 ,3,4}. Эти последние технологические достижения позволяют добиться более глубокого понимания механизмов, связанных с переводом upregulation или репрессий конкретные мРНК в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастазов^{5 ,6,,78}. Однако большинство из этих методов требуют дорогих или опасных реагентов и специального оборудования, которые не могут быть доступны для большинства лабораторий. Таким образом был разработан эффективный метод для быстрой оценки перевод событий специально обойти эти потенциальные проблемы. Этот метод обнаруживает острый трансляционная модуляций, которые происходят во время конкретных клеточных процессов, а также позволяет для локализации перевода с помощью конфокальной микроскопии.

Описанные здесь методы были использованы для мониторинга локализованный перевод в течение субцеллюлярные отсеков под названием распространяя возбуждение центров (SIC)⁵. Шиц являются переходных структур, обнаруженных в сеяный клеток, которые локализуются на вершине зарождающейся адгезии комплексов. Хотя Шиц и адгезии комплексы отличаются друг от друга, их судьбы тесно связаны. Действительно SICs известны постепенно исчезают после фокуса адгезии комплекс созревания в сайт адгезии на начальном этапе адгезии. Мы обнаружили, что RNA-связывая протеинов, известный специально контролировать мРНК перевода (например, Sam68, FMRP и G3BP1) и polyadenylated, РНК обогатились в рамках этих структур⁵. С помощью методов, описанных здесь, мы показали, что регулирование SIC-связанные мРНК, перевод действует как КПП позволяет посеян клетки для консолидации клеточной адгезии. Этот метод, основанный на puromycin включения, можно считать адаптированную версию поверхности зондирования перевод пробирного (закат). Первоначально разработанный для измерения скорости синтеза глобального белка с помощью радиоактивно обозначенные аминокислоты, протеин puromycilation предлагает эффективный способ визуализации белка de novo синтеза⁹. Этот метод полагается на внутренние поведение puromycin, антибиотик, который блокирует перевод через прекращение преждевременной цепи в рибосома¹⁰. Действительно puromycin структурно аналогичен тирозил тРНК, который позволяет для включения в удлинения пептидные цепи через образование пептидных связей. Однако puromycin привязки к растущей цепи пептида предотвращает формируется с следующей аминоацил тРНК, так как puromycin не hydrolysable Амид облигаций вместо hydrolysable Эстер Бонд в tRNAs нового Бонда пептид. Таким образом включение puromycin в удлинения полипептиды приводит к преждевременной выпуска многочисленных усеченная puromycilated полипептиды, соответствующий активно переводится мРНК^9,11,12 .

С помощью этого метода, можно было оценить активный перевод в течение короткого времени вдова (например, 5 минут) во время клеточной адгезии с использованием специфического антитела, направленные против puromycin на клетки, которые были дополнены антибиотика для периодов 5-мин в точках в разное время в ходе процесса адгезии клеток⁵. Точность этот assay полагается на весьма специфические антитела, направленные против puromycilated группу. Immunofluorescent обнаружения puromycilated полипептида обеспечивает общий субцеллюлярные передел недавно переведенные мРНК, которые также могут быть количественно с большой точностью с помощью конфокальной систем тепловидения.

Следовательно этот метод предлагает соответствующую опцию для большого числа лабораторий, изучая трансляционная регулирующих механизмов, участвующих в процессах таких нейронов грануляции^{6,13,14, 15}, morphogen мРНК локализации и перевода во время развития^16,17. Это также хорошо подходит для изучения локализованных или разобщенным перевод во время быстрого биологических событий, например миграции клеток, адгезии или вторжения, или просто оценить медикаментозного лечения, которые могли бы побудить поступательные изменения^{5, 7 , 18}. в целом, этот метод позволяет для визуализации событий локализованных или контролируемых перевод в быстрый, точный и экономически эффективным способом.