Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום
Summary
כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.
Abstract
מנגנוני ויסות ה-mRNA תרגום מעורבים תהליכים ביולוגיים שונים, כגון פיתוח קו נבט, תאית התמיינות organogenesis, כמו גם מחלות מרובות. פרסומים רבים הראו בצורה משכנעת למנגנונים הספציפיים לווסת בחוזקה mRNA תרגום. עניין גדל בוויסות הנוצרות על-ידי תרגום של ביטוי חלבון הובילה בפיתוח שיטות רומן ללמוד ולעקוב אחרי דה נובו חלבון סינתזה ב- cellulo. עם זאת, רוב השיטות האלה הם מורכבים, הפיכתם יקר, לעיתים קרובות הגבלת מספר מטרות mRNA שניתן ללמוד. כתב יד זה מציעה שיטה הדורשת רק בסיסי ריאגנטים, מערכת הדמיה פלורסצנטיות קונאפוקלית כדי למדוד והמחש את השינויים בתרגום mRNA המתרחשים בכל שורת התאים בתנאים שונים. לאחרונה להשתמש בשיטה זו כדי להציג תרגום לשפות אחרות המבנים subcellular של תאים חסיד על פני תקופה קצרה של זמן, ולכן מציע את האפשרות להמחיש תרגום דה נובו לתקופה קצרה במהלך מגוון ביולוגי תהליכים או של אימות שינויים בפעילות translational בתגובה לגירויים מסוימים.
Introduction
התקנון של תרגום על ידי תאיים שונים יש בקשה רבים צוותי המחקר לפתח כלים חדשים, שיטות לקביעת ההתאמה subcellular של mRNA תרגום וחלבון מוסדר סינתזה1,2 ,3,4. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות אלה מאפשרים הבנה משופרת של המנגנונים הקשורים קולטנים upregulation תרגום או הדיכוי של mRNAs ספציפי במהלך תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות5 ,–6,–7,–8. עם זאת, רוב השיטות האלה דורשים יקר או מסוכנים ריאגנטים וציוד ספציפי כי לא יכול להיות זמין ברוב מעבדות. ככזה, פותחה שיטה חסכונית כדי לאפשר ההערכה המהירה של תרגום אירועים לעקוף באופן ספציפי אלה בעיות פוטנציאליות. שיטה זו מזהה חריפה האפנון translational להתרחש במהלך תהליכים תאיים ספציפיים, מאפשר גם עבור ההתאמה של תרגום באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
השיטות המתוארות כאן שימשו כדי לפקח על תרגום לשפות אחרות בתוך תאי subcellular שנקרא חניכה מתפשטת מרכזי (SIC)5. SICs הם מבנים ארעיים נמצאו בתאים הזריעה מותאמים על מתחמי אדהזיה המתהווה. למרות SICs, מתחמי אדהזיה ברורים, וגורלם הדוק. אכן, SICs ידועים להיעלם בהדרגה עם ההבשלה מורכבים אדהזיה מוקד לתוך אתר אדהזיה בשלב הראשוני של הידבקות. מצאנו כי RNA מחייב חלבונים ידוע בקרה ספציפית על תרגום ה-mRNA (למשל, Sam68, FMRP, ו G3BP1) ומבנים polyadenylated RNAs היו מועשר בתוך אלה5. שימוש בשיטות המתוארות כאן, הראינו כי ברגולציה של mRNA SIC-הקשורים תרגום משמש מחסום ומאפשר נזרע תאים כדי לאחד אדהזיה תא. שיטה זו, המבוססת על תאגיד puromycin, יכול להיחשב גירסה מותאמת של חישת משטח תרגום assay (שקיעה). פותח במקור כדי למדוד את המחירים סינתזת חלבון העולמי באמצעות של חומצת אמינו שאינן radioactively שכותרתו, חלבון puromycilation מציע דרך יעילה כדי להמחיש סינתזה של חלבון דה נובו 9. שיטה זו מתבססת על ההתנהגות מהותי של puromycin, אנטיביוטיקה החוסמת תרגום דרך שרשרת מוקדמת סיום ריבוזום10. אכן, puromycin הוא מקביל מבחינה מבנית tyrosyl-tRNA, המאפשר השתלבות מתארך פפטיד שרשראות דרך היווצרות של קשר פפטידי. לעומת זאת, מחייב puromycin שרשרת פפטיד גדל מונעת של קשר פפטידי חדשה נוצרת עם הבא aminoacyl-tRNA, מאז puromycin יש קשר אמיד hydrolysable במקום הקשר אסתר hydrolysable נמצאו ב- tRNAs. לפיכך, שילוב של puromycin לתוך מתארך polypeptides תוצאות במהדורה מוקדמת של polypeptides puromycilated קטום רבים המתאימים מתורגם באופן פעיל mRNA9,11,12 .
באמצעות שיטה זו, ניתן היה להעריך פעיל תרגום בתוך אלמנה זמן קצר (למשל, 5 דקות) במהלך אדהזיה הסלולר באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד puromycin על תאים היו בתוספת האנטיביוטיקה לתקופות 5-מין בנקודות זמן שונות במהלך תהליך אדהזיה5תאים. הדיוק של שיטת זו מסתמכת על נוגדנים ספציפיים מאוד נגד את moiety puromycilated. זיהוי immunofluorescent מפוליפפטיד puromycilated מספק של repartition subcellular הכללי של mRNA שתורגם, אשר גם ניתן לכמת בדיוק רב באמצעות מערכות הדמיה קונפוקלי.
לכן, השיטה מציעה אופציה רלוונטית עבור מספר רב של מעבדות לימוד מנגנוני הרגולציה translational המעורבים בתהליכים כגון פרור עצביים6,13,14, 15, מורפוגן mRNA לוקליזציה ותרגום במהלך פיתוח16,17. זה גם מתאים במיוחד לימודי תרגום לשפות אחרות או ממודר במהלך מהיר אירועים ביולוגיים כגון נדידת תאים, הדבקות או חדירה או להעריך פשוט טיפולים בסמים עלול לגרום שינויים translational5, 7 , 18. בסך הכל, שיטה זו מאפשרת עבור הפריט החזותי של אירועים תרגום לשפות אחרות או מבוקר בצורה מהירה, מדויקת וחסכונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות איפשרו הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים translational קולטנים upregulation או הדיכוי של mRNAs ספציפיים של תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות. המתודולוגיה חסכונית המתוארים כאן מאפשר תרגום אירועים, ניתן לאבחן בתאים כדי ללמוד כיצד RNA מחייב חלבונים לה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר ראשיד Mazroui (אוניברסיטת לאוול, קוויבק, קנדה) על קריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים יחידת דימות תא של המרכז לחקר לסיוע טכני שלהם. Huot מé. הוא חוקר המחקר ג’וניור 1 דה Fonds du רשרש קוויבק-Santé (FRQ-S). עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק מספר CIHR, מגב-286437 למ-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
