単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

注意：抽出中に使用されるメタノール（MeOH）およびメチルtert-ブチルエーテル（MTBE）は引火性があり、長期間暴露および/または接触すると、呼吸器系、眼または皮膚の刺激を引き起こす可能性があります。煙霧フードでのみ取り扱ってください。抽出中に適切な安全手順（ラボコート、安全眼鏡、手袋など ）を使用してください。このプロトコールのいくつかのステップで使用される液体窒素とドライアイスは、長期にわたる皮膚接触によって重度のやけどを引き起こす可能性があります。保護手袋と眼鏡を着用して慎重に取り扱ってください。ユーザーは、サンプル分析にさまざまな化学物質、試薬または内部標準を使用することができます。そのうちのいくつかは毒性があります。使用されるすべての物質について、関連する化学物質安全性データシートを調べてください。 1.生物学的サンプルの採取と収穫標識採取管を準備する。 注：ここでは、標識された2 mL、丸底、安全なloc2つの直径5mmの組織ホモジナイザーのための金属ボールを含む2つのマイクロ遠心チューブ。 満たされた液体窒素デュワーを準備する。 生物学的サンプルを採取し、組織を液体窒素中で急速に凍結させる。創傷によって引き起こされる代謝変化を避けるために、このステップを数秒以内にできるだけ早く実行してください。 注：デモの目的で、長い日の条件で土壌に生育した30日齢の野生型シロイヌナズナ （Col-0）のロゼット葉を使用してください。 収穫したサンプルをドライアイス上に短期間休憩するか、-80℃で長期間保存してください。 2.粉砕および組織破壊組織ホモジナイザーのチューブホルダーを液体窒素中で少なくとも10分間あらかじめ冷却する。ティッシュホモジナイザーが利用できない場合は、清潔であらかじめ冷却したモルタルと乳棒を使用してください。 液体窒素、ドライアイスまたは-80℃冷凍庫からサンプルを取り出し、プレ冷却したものチューブホルダー。 チューブホルダーを組織ホモジナイザーにすばやく入れます。 生物学的物質を細かく均一な粉末に粉砕する。葉は20 Hzで1分間使用してください。 注意;組織に応じて均質化の時間と速度を変えることができます。サンプルがホモジナイズして細かい粉末になっていることを確認し、ホモジナイゼーションのすべてのステップでこの粉末を凍らせます。 チューブホルダーから生物学的サンプルを取り出し、さらに抽出するまで凍らせておいてください。 3.組織の重量測定必要なサンプル量に十分な精度の分析天びんを使用してください。 ラベルが付いた2 mLの丸底安全ロックマイクロチューブを準備する。 チューブとスパチュラを液体窒素で予め冷却してください。 必要な量の組織粉末を2 mLセーフロックマイクロ遠心チューブに分注する。 注意：wにかかる時間を最小限に抑えて植物材料の解凍を避けるサンプルを集める。 液体窒素に秤量した直後にアリコート試料を戻す。 各サンプルの正確な重量を記録する。ほとんどの植物組織に10〜50 mg±10％を使用してください。 – 抽出するまで分取したサンプルを-80℃で保存する。 4.試薬のセットアップ メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）/メタノール（MeOH）の抽出混合物を使用する。 抽出溶媒100mLの調製のために、75mLのMTBEを25mLのMeOHに加えて、MTBE：MeOH（3：1、vol / vol）の混合物を作製する。 分析ニーズに応じて、分析後の標準化のための内部標準を追加します。典型的にはUPLC-MSに基づく脂質分析のための内部標準として50μLの1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（クロロホルム中1mg / mL）を添加する一方、50μLの13 Cソルビトール（ 1 mg / mLの水中）を、GC-MSに基づく一次代謝産物。 UPLC-MSに基づく代謝物分析のための内部標準は、コルチコステロン50μL（メタノール中1mg / mL）およびアンピシリン（メタノール中1mg / mL）25μLである。 MTBE：MeOH混合物でリンスしたきれいなガラス瓶に溶媒を移す。 抽出混合液は4℃で1週間保存してください。 注：再現性のある結果を維持するために、抽出混合物を長期間保管しないでください。 相分離を誘発するために、水（H 2 O）/メタノール（MeOH）を使用する。 100mLのH 2 O：MeOHの調製のために、75mLのH 2 Oを25mLのMeOHに加えてH 2 O：MeOH（3：1、vol / vol）を製造する。 H 2 O：MeOH混合物でリンスしたきれいなガラス瓶に溶媒を移す。この溶媒は、室温で数週間保存することができます。 サンプルの抽出抽出前に冷却する液体冷却システムまたは-20℃冷凍庫を使用して-20℃に冷却する（MTBE：MeOH、3：1、vol / vol）。 アリコートに分けられたサンプルを1つずつ取り出し、1mLの予め冷却した抽出混合物を各サンプルチューブに加える。注意：MTBEの粘度が低いため、この手順を迅速に実行してください。 組織が抽出混合物内で十分にホモジナイズされるまで、ボルテックスミキサーで直ちに混合する。 注：このステップは、タンパク質を沈殿させ、その酵素活性を不活性化する必要があるので、非常に重要である。 オービタルシェーカー上のすべてのサンプルを100 rpmで45分間4℃でインキュベートする。 氷冷超音波浴で15分間試料を超音波処理する。 6.相分離による分別 650μLのH 2 O：MeOH（3：1、vol / vol）を各試料管に加える。 1分間ボルテックスしてよく混合する。 サンプルを4℃で5分間20,000 x gの速度で遠心分離する。注記：このステップの後、チューブの底に固体ペレットを含む2つの混和しない液相が存在します。 注意：2つの液相が混ざるのを避けるために注意してチューブを取り扱い、沈殿したペレットを破壊しないように注意してください。 7.極性および疎水性画分のアリコート 500μLの溶媒を上部の脂質含有相から1.5mLのマイクロ遠心チューブに移す。 注：一定分量の脂質サンプルは、直ちにUPLC-MS分析（ステップ8.1）のために直接濃縮するか、または-80℃で数週間保存することができます。 試料から500μLを一旦除去したら、200μLのピペットを用いて残りの脂質相を除去する。 下の相（極性および半極性代謝産物）から標識された1.5 mL微量遠心管に400μLの溶媒を移します。分取された極性サンプルは、即時UPLC-MS分析のために直接濃縮することができ（ステップ8.2）-80℃で数週間。 200μLの追加分取液を追加して、例えば、ガスクロマトグラフィーに基づく代謝産物分析などを行います（ 16） 。 過剰量をピペッティングして水相の残りを除去する。 得られたタンパク質、デンプン、細胞壁ペレットを500μLのメタノールで1分間完全にボルテックスして洗浄する。 10,000xgの速度で5分間4℃でサンプルを遠心分離する。 先に述べたようにタンパク質の抽出と消化（ステップ11）またはデンプン/細胞壁分析を行います16 。 注：すぐに使用しない場合、これらのペレットは-80℃で数週間保存することができます。 8.画分の濃縮および保存加熱しない真空濃縮器（1〜2時間）または好ましくはニトリルを使用して、脂質サンプル（ステップ7.1から）から溶媒を蒸発させる。脂質の酸化的修飾を避けるためにogen flow evaporatorを使用してください。 注：乾燥サンプルはすぐに分析する必要があります。保管のために、試料をガラスバイアル中の理想的にはMTBE溶液に残す（ステップ7.1）。 加熱せずに真空濃縮器で一晩（ステップ7.3または7.4の）水性サンプルから溶媒を蒸発させる。注：乾燥したサンプルは分析前に-80℃で数週間保存することができます。 UPLC-MSを用いた脂質分析24 400μLのアセトニトリル：2-プロパノール（7：3、vol / vol）中で乾燥した脂質画分（ステップ8.1から）を再懸濁する。 十分な液体をガラスバイアルに移し、しっかりと蓋をする。 ガラスバイアルを冷却オートサンプラー（4℃）に入れます。 1サンプルあたり2μLを注入し、400μL/分の流速で作動するUPLCシステムを用いて60℃に保持された逆相（RP）C 8カラムで脂質を分離する。 モバイルを使用するクロマトグラフィー分離のために表1に記載されている。 150〜1,500 m / zの質量範囲をカバーする適切なMS装置を使用して、陽イオン化モードおよび陰イオン化モードで質量スペクトルを取得する。 UPLC-MSを用いた極性および半極性代謝物の分析25 。 200μLのUPLCグレードのメタノール：水（1：1、vol / vol）中で極性相（ステップ8.2から）を再懸濁する。 十分な液体をガラスバイアルに移し、しっかりと蓋をする。 ガラスバイアルを冷却オートサンプラー（4℃）に入れます。 各サンプルから2μLを注入し、流速400μL/分で稼動するUPLCシステムを使用して40℃に保持されたRP C 18カラムで代謝産物を分離する。 表2に示すパラメーターを用いてクロマトグラフィー分離に移動相を使用する。 陽イオン化モードと陰イオン化モードでフルスキャンマススペクトルを取得50〜1,500 m / zの質量範囲をカバーする適切な質量分析計を使用してください。 11.タンパク質抽出、消化および分析16 選択したタンパク質抽出バッファー200μL中で洗浄したタンパク質/デンプン/細胞壁ペレット（ステップ7.8から）を再懸濁する。注：尿素/チオ尿素緩衝液（5M尿素、2mMチオ尿素、15mM DTT、2％CHAPSおよびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤）を使用する。 氷冷した音波浴で10分間試料を超音波処理する。 サンプルを室温でオービタルシェーカー（100rpm）で30分間インキュベートする。 溶解したタンパク質を10,000 x gで5分間遠心します。 新しいチューブにタンパク質上清を集める。 収集した上清28からタンパク質濃度を決定する。 選択したプロトコールで溶液中のタンパク質50μgを消化する。典型的には、Trypsin / Lys-C mix accordi取扱説明書を参照してください。 消化後、C 18段階チップを用いて質量分析に先立ってペプチドの脱塩を行い、消化されたペプチド29を溶出する。 試料を加熱せずに真空濃縮器でほぼ乾燥状態に濃縮する。 適切なローディングバッファー（例えば5％アセトニトリル、0.5％ギ酸）でサンプルを再懸濁し、ナノLCシステムに接続された高分解能質量分析計を使用してLC-MS / MSによりペプチド混合物を分析する。 注記：このプロトコールで提示された例示的なプロテオミクスデータセットでは、 表3に記載されるような勾配を使用した。 1回のフルスキャン（FS）の後に最大15のデータ依存MS / MSスキャンが続く上位15の戦略を使用して、質量分析計を次のパラメータに設定します。FSは質量範囲200〜2,000 m / z目標値3×10 6のイオンで70,000の分解能。データ依存のMS / MSスキャンを上位エンコードで取得するrgy collisional dissociation（HCD）。最大イオン充填時間50 ms、アイソレーションウィンドウ4.0 m / z、正規化衝突エネルギー（NCE）30％、アンダーフィル比1％のMS / MSの目標値を1e 5イオンに設定します。 MS / MSイオンを17.500の分解能で測定し、動的除外を60秒に設定した。