JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Published: June 01, 2017
doi:
10.3791/55802
, , ,
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Germany, 2Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy,Cairo University

Summary

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Abstract

Karmaşık biyolojik sistemlerin anlaşılması, genellikle transkriptomik, proteomik, metabolomik ve lipidomik ölçümlerle belirlenen, canlı hücrenin çoklu bileşik sınıflarının ölçülmesi, analizi ve entegrasyonunu gerektirir. Bu protokolde, metabolitlerin, lipidlerin ve proteinlerin biyolojik dokulardan, örnek başına tek bir alikot kullanılarak tekrarlanabilir şekilde ekstraksiyonu için basit bir yöntem sunuyoruz. Ekstraksiyon metodu sıvı için bir metil tert -butil eter: metanol: su sistemi üzerine kuruludur. Hidrofobik ve kutupsal metabolitlerin protein ve diğer macromoleküllerin katı bir pellet olarak çökeltilmesiyle birlikte karışmayan iki faza sıvı ile bölünmesi. Bu nedenle, bu yöntem, kütle spektrometreleriyle birleştirilen sıvı kromatografi (LC) veya gaz kromatografisi (GC) gibi ortak yüksek verimli 'omiks' teknolojileri ile tamamen uyumlu üç farklı fraksiyona özel moleküler kompozisyon sağlar. Yöntem init olmasına rağmenFarklı bitki doku örneklerinin analizi için geliştirilmiş olup yosunlar, böcekler ve memeli dokuları ve hücre kültürleri gibi çeşitli sistemlerden biyolojik numunelerin çıkarılması ve analizi için tamamen uyumlu olduğu kanıtlanmıştır.

Introduction

Geçen yüzyılın ortalarında ortaya çıkan ve genomik ve transkriptomik veri setleri 2 , 3'ün geniş ölçekli analizi ile geliştirilen sistem biyolojisi, kompleks biyolojik sistemlerin analizi için yeni ve vazgeçilmez bir yaklaşım haline geldi 4 , 5 . Sistem biyolojisinin temel amacı, biyolojik sistemlerde bileşen etkileşimlerini ve bağımlılıklarını deşifre etmek ve genotipler arasındaki bağlantıyı, gerçekleşmelerini, moleküler dönüşümlerini ve elde edilen fenotipleri köprü kurmaktır. Buna göre, genomik, transkriptomik, metabolomik, lipidomik ve proteomik gibi çeşitli büyük ölçekli analitik yaklaşımlarla üretilen kapsamlı veri kümelerinin entegrasyonu ve hesaplama analizi, karmaşık biyolojik sistemlerin tanımlanması ve anlaşılması için bir ön şart haline gelmiştir.

Bas Büyük bir kimyasal çeşitlilik ve biyolojik bileşenlerin herhangi bir canlı sistemdeki karmaşıklığı üzerine, büyük ve kapsamlı 'omiks' veri setlerinin üretimi, uygulanan özütleme yönteminin kalitesi 9 üzerinde büyük bir oranda güvenir. Ayıklama yönteminin kalitesine ek olarak yöntemin ekonomisi de önemlidir; Bu, mümkün olduğunca az numune girişi kadar moleküler bilgi elde etmek için arzu edilir olduğu anlamına gelir. Genellikle numune miktarları sınırlayıcı olabilir ve bu nedenle verilen bir numunenin tek bir ekstraksiyonundan birçok moleküler sınıf elde edebilen bir ekstraksiyon yönteminden faydalanmak son derece arzu edilir. Bu, aynı numunenin farklı örnek alikotlarından farklı bileşik sınıflarının ekstraksiyonu için birkaç özel özütleme yöntemi kullanmak yerine, tek bir bölümün moleküler bileşenlerini farklı molekül fraksiyonlarına parçalayan ardışık bir özütleme yöntemi kullanılır.

Bu fraksiyonlu ekstraksiyon yöntemleri için kullanılan ortak yöntem, 1957'de geliştirilen Folch ve arkadaşlarının iki fazlı lipid özütleme yöntemine dayanmaktadır.10 Bu yöntem, polar ve hidrofobik metabolitlerin bir kloroform: metanol / su bölünmesine dayalıdır ve Yüksek kalitede lipid analizi için temizleme ve de-kompleks numuneleri tasarlamayı amaçlar.Folch yöntemi, çoklu omik sistem biyolojisinin gelişmesiyle birlikte, proteinlerin ve kutup metabolitlerinin ve lipidlerin numune bölümlemesi için kullanıldığı için aşamalı olarak geliştirildi. Sıvı ve sıvı kromatografi tabanlı metabolomik ve polar ve hidrofobik bileşiklerin lipidomikleri, sıvı kromatografi tabanlı proteomiklere 11 , 12 , 13 , 14 ek olarak . Ne ​​yazık ki, bu yöntemlerin tümü kloroform esaslı bir özütleme yöntemine dayanmaktadır, bu yöntem sadece IstenmeyenProtein pelletinin polar ve lipid fazı arasındaki bir ara faz olarak bulunması, fakat aynı zamanda yeşil bir kimya perspektifinden istenmeyen bir solvent olan 15,16. Bununla birlikte, çözücü metil tert -butil eter (MTBE), yukarıda belirtilen bu problemlerin ikisini de üstesinden gelir ve kloroform için uygun bir yedektir. Bu gerekliliklere dayanarak, yukarıda bahsedilen özelliklerin tümünü yerine getiren ve dolayısıyla kapsamlı çoklu omik analiz için ideal bir başlangıç ​​noktası olarak işlev gören bir MTBE: metanol: su bazlı özütleme yöntemi oluşturmaya karar verdik.

Bu protokol, yaygın olarak gözlemlenen sorunların gidermek de dahil olmak üzere kullanıcıyı adım adım basit, hızlı ve tekrarlanabilir iş akışıyla adım adım yönlendirir. Ayrıca, ultra-performans sıvı kromatografısi-kütle spektrometresinden (UPLC-MS) örneklenmiş analitik verileri kısaca tanıtacağız -basLipidomik, metabolomik ve proteomik profilleme yöntemleri. Verilen örnekler, 50 mg bir Arabidopsis thaliana yaprak doku örneğinden türetilmiş olsa da, bu protokol algler 17 , 18 , böcekler 19 ve memeli hücreleri, organlar ve dokular 20 , 21 , 22 . Sunulan ekstraksiyon protokolünün kapsamı, ekstraksiyon öncesi numune alma işleminin ve ekstraksiyon işleminin kendisinin açık ve ayrıntılı bir tanımını sağlamaktır. Analitik uygulama için üç kısa örnek sunsak bile, analitik ve analitik olmayan veri işleme hakkında ayrıntılı bilgi, önceki yayınlarımız olan 16 , 23 , 24 , <supClass = "xref"> 25 , 26 .

Protocol

Dikkat : Ekstraksiyon esnasında kullanılan metanol (MeOH) ve metil tert -butil eter (MTBE) yanıcıdır ve uzun süreli maruz kalma ve / veya temas durumunda solunum, göz veya cilt tahrişine sahip olabilir. Lütfen bunları dikkatli bir şekilde davlumbazda tutun ve özümleme işlemi sırasında uygun güvenlik önlemlerini (laboratuar önlüğü, güvenlik gözlüğü, eldiven vb. ) Kullanın. Bu protokolün birkaç adımında kullanılan sıvı nitrojen ve kuru buz, cilt ile uzun süre temas ederse ciddi yanıklara neden olabilir. Lütfen koruyucu eldiven ve gözlük takarak onları dikkatli bir şekilde tutun. Kullanıcılar, bazıları zehirli olabilecek numune analizi için farklı kimyasallar, reaktifler veya dahili standartlar kullanabilirler. Kullanılan tüm kimyasal maddeler için ilgili kimyasal güvenlik bilgi formlarını inceleyiniz. 1. Biyolojik Örneklerin Toplanması ve Toplanması Etiketli hasat tüpleri hazırlayın. NOT: Burada, etiketli, 2 mL, yuvarlak tabanlı, güvenli lokta biyolojik numuneler hasat edilirK mikrosantrifüj tüpleri, doku homojenleştirici için iki adet 5 mm çaplı metal top içerir. Dolu bir sıvı azot dewar'ı hazırlayın. Biyolojik numuneyi toplayın ve dokuyu sıvı nitrojende dondurun. Yaralanmadan kaynaklanan metabolik değişiklikleri önlemek için bu adımı birkaç saniye içinde olabildiğince çabuk yapın. Not: Gösteri amaçlı olarak, uzun gün koşulları altında toprakta yetiştirilen 30 günlük yabani tip Arabidopsis thaliana (Col-0) rozet yaprağı kullanın. Hasat edilen numuneleri kısa süreli molalar için kuru buzda tutun veya daha uzun süre -80 ° C'de saklayın. 2. Öğütme ve Doku Kesintisi Doku homojenleştiricisinin tüp tutucularını sıvı azot içinde en az 10 dakika önceden soğutun. Bir doku homojenleştirici yoksa, temiz ve önceden soğutulmuş harç ve havlu kullanın. Sıvı azot, kuru buz veya -80 ° C dondurucudan numuneleri alın ve bunları ön soğutmalıTüp tutucuları. Boru tutucularını doku homojenleştiricisine çabucak koyun. Biyolojik materyali ince ve homojen bir toz haline getirin. Yapraklar için 1 dakika 20 Hz kullanın. Not; Homojenizasyon zamanı ve hızı dokuya bağlı olarak değişebilir, numunenin ince bir toz haline homojen hale getirildiğinden ve bu tozun homojenizasyonun her adımında dondurulduğundan emin olun. Biyolojik örnekleri tüp tutucularından alın ve daha ileri çıkana kadar dondurun. 3. Dokuların tartılması Gerekli örnek miktarları için yeterli hassasiyette analitik bir denge kullanın. Etiketli 2 mL'lik yuvarlak tabanlı emniyetli mikro santrifüj tüpünü hazırlayın. Tüpleri ve spatulaları sıvı nitrojende önceden soğutun. Gerekli miktarda doku tozu 2 mL güvenli kilit mikrosantrifüj tüpüne bölün. Dikkat: Bitki materyalinin çözündürülmesini önlemek için wÖrnekleri okuyun. Ölçülen numuneleri, sıvı nitrojene tartıldıktan hemen sonra gönderin. Her bir numune için kesin ağırlığı kaydedin. Çoğu bitki dokusu için 10-50 mg ±% 10 kullanın. Ayrılmış örnekleri -80 ° C'de daha fazla ekstraksiyona kadar saklayın. 4. Reaktif Ayarları Metil tert -butil eter (MTBE) / metanol (MeOH) ekstraksiyon karışımı kullanın. 100 mL ekstraksiyon solventi hazırlamak için, MTBE: MeOH (3: 1, hacim / hacim) karışımı elde etmek için 75 mL MTBE'yi 25 mL MeOH'a ilave edin. Analitik ihtiyaçlara göre post analizi normalleştirme için dahili standartlar ekleyin. Tipik olarak, 50 uL 1,2-diheptadekanoil- sn -glisero-3-fosfokolin (kloroformda 1 mg / mL), UPLC-MS temelli lipid analizi için bir dahili standart olarak ilave edilirken, 50 uL 13 C sorbitol 1 mg / mL su içinde), GC-MS bazlı primer analiz için dahili standartlar olarakmetabolitleri. UPLC-MS'e dayalı metabolit analizi için dahili standartlar, 50 μL kortikosteron (metanolde 1 mg / mL) ve 25 μL ampisilin (metanolde 1 mg / mL )'dir. Çözücüyü, MTBE: MeOH karışımı ile durulanmış temiz bir cam şişeye aktarın. Ekstraksiyon karışımını 4 ° C'de 1 haftaya kadar saklayın. NOT: Yeniden üretilebilir sonuçların korunması için ekstraksiyon karışımını daha uzun süre muhafaza etmeyin. Faz ayrımını başlatmak için su (H2O) / metanol (MeOH) kullanın. 100 mL H20: MeOH hazırlamak için, H20: MeOH (3: 1, hacim / hacim) yapmak için 25 mL MeOH'ye 75 mL H20 ilave edilir. Çözücüyü, H20: MeOH karışımı ile durulanmış temiz bir cam şişeye aktarın. Bu çözücü oda sıcaklığında birkaç hafta saklanabilir. 5. Örneklerin Çıkarılması Ekstraksiyon ön-soğutmalı mSıvı soğutma sistemi veya -20 ° C dondurucu kullanarak -20 ° C'ye soğutulur (MTBE: MeOH, 3: 1, hac / hac). Aliquoted örnekleri teker teker alın ve her örnek tüpüne önceden soğutulmuş ekstraksiyon karışımı 1 mL ekleyin. Dikkat: MTBE'nin düşük viskozitesi nedeniyle bu adımı hızlı bir şekilde uygulayın. Doku, ekstraksiyon karışımı içinde iyi homojen olana kadar hemen bir vorteks mikseri üzerinde karıştırın. NOT: Proteinlerin çökeltilmesi ve enzimatik faaliyetlerinin inaktive edilmesi nedeniyle bu adım çok önemlidir. Bütün numuneleri bir yörünge çubuğu üzerindeki 100 rpm'de 45 ° C'de 4 ° C'de inkübe edin. Numuneleri, buzla soğutmalı bir sonikasyon banyosunda 15 dakika sonikasyon yapın. 6. Faz Ayırımı ile Fraksiyonasyon Her numune tüpüne 650 uL H20: MeOH (3: 1, hacim / hacim) ilave edin. 1 dakika vortekslenerek iyice karıştırın. Numuneleri 4 ° C'de 5 dakika süreyle 20.000 x g hızında santrifüjleyin. NOT: Bu adımdan sonra, tüpün tabanında katı bir pelet olan iki karışmaz sıvı faz bulunmaktadır. Dikkat: İki sıvı fazın karışmasını önlemek için tüpleri dikkatle tutun ve çökelen pelletin bozulmasını önleyin. 7. Kutupsal ve Hidrofobik Kesirlerin Ayırımı Solüsyonun 500 μL'sini lipit içeren üst fazdan etiketli bir 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Aliquoted lipid örnekleri doğrudan UPLC-MS analizi (adım 8.1) için konsantre edilebilir veya -80 ° C'de birkaç hafta saklanabilir. Örnekten 500 μL alındığında, 200 μL'lik bir pipet kullanarak kalan lipid fazını çıkarın. Alt fazdan (polar ve yarı polar metabolitler) 400 μL solventi etiketli bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aliquoted kutup örnekleri hemen UPLC-MS analiz (adım 8.2) için doğrudan konsantre edilebilir veya-80 ° C'de birkaç hafta. İlave analiz yapmak için 200 uL'lik ek bir örnek alınız, örn. Kosmetik olarak tanımlanan gaz kromatografisine dayalı metabolit analizi 16 . Aşırı miktarı pipetle atarak sulu fazın kalan kısmını çıkarın. Elde edilen protein, nişasta, hücre duvarı pelletini 1 dakika süreyle vorteksleyerek 500 μL metanol ile yıkayın. Örnekleri 10,000 x g hızında 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Daha önce tarif edildiği gibi 16 protein ekstraksiyonu ve sindirim (adım 11) veya nişasta / hücre duvar analizi yapın. NOT: Hemen kullanılmazsa, bu topaklar -80 ° C'de birkaç hafta saklanabilir. 8. Fraksiyonların Konsantrasyonu ve Depolanması Çözücüyü lipid örneklerinden (basamak 7.1'den) ya ısıtmadan ısıtın (1-2 saat boyunca) bir vakum konsantratörde buharlaştırın ya da tercihen bir nitrLipidlerin oksidatif modifikasyonlarını önlemek için ojen akış buharlaştırıcısı. NOT: Kurutulmuş numuneler derhal analiz edilmelidir. Depolama için örnekleri MTBE çözeltisi içinde, ideal olarak cam şişelerde bırakın (adım 7.1). Çözücüyü sulu numunelerden (adım 7.3 veya 7.4'ten) bir gece boyunca bir vakum konsantratöründe ısıtmadan ısıtın. NOT: Kurutulmuş numuneler, analizden önce birkaç hafta boyunca -80 ° C'de saklanabilir. 9. Lipidlerin UPLC-MS 24 ile Analizi 400 μL asetonitril: 2-propanol (7: 3, hacim / hacim) içinde kurutulmuş lipid fraksiyonlarını (adım 8.1'den) tekrar süspansiyon haline getirin. Cam şişelere yeterli miktarda sıvı aktarın ve sıkıca kapatın. Cam şişeleri soğutmalı bir otomatik örnekleyiciye (4 ° C) yerleştirin. Örnek başına 2 μL enjekte edin ve 400 μL / dak'lık bir akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanılarak 60 ° C'de tutulan bir Reversed Phase (RP) C8 sütunundaki lipidleri ayırın. Cep telefonunu kullanKromatografik ayırma için Tablo l' de açıklanan safhalar. 150 ve 1,500 m / z arasındaki kütle aralığını kapsayan uygun bir MS enstrümanı kullanarak pozitif ve negatif iyonizasyon modunda kitle spektrumlarını elde edin. 10. Kutupsal ve Yarı Kutuplu Metabolitlerin UPLC-MS 25 ile Analizi. 200 μL UPLC dereceli metanol: su (1: 1, hacim / hacim) içinde kutup fazını tekrar tekrar askıya alın (basamak 8.2'den itibaren). Cam şişelere yeterli miktarda sıvı aktarın ve sıkıca kapatın. Cam şişeleri soğutmalı bir otomatik örnekleyiciye (4 ° C) yerleştirin. Her bir örnekten 2 μL enjekte edin ve 400 μL / dak'lık bir akış hızında çalışan bir UPLC sistemi kullanarak 40 ° C'de tutulan bir RP C 18 sütunundaki metabolitleri ayırın. Tablo 2'de verilen parametrelerle mobil fazları kromatografik ayırma için kullanın. Pozitif ve negatif iyonizasyon modunda tam tarama kütle spektrumu elde edin50 ila 1,500 m / z arasında bir kütle aralığını kapsayan uygun bir kütle spektrometresi. 11. Protein Ekstraksiyonu, Sindirim ve Analiz 16 Seçilen protein ekstraksiyon tamponunun 200 μL'sinde yıkanmış protein / nişasta / hücre duvarı pelletini (adım 7.8'den) yeniden askıya alın. Not: Üre / tiyoüre tamponu (5 M üre, 2 mM tiyoüre, 15 mM DTT,% 2 CHAPS ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri) 27'yi kullanırız. Numuneleri, buzla soğutulmuş sonik bir banyoda 10 dakika Sonikasyon yapın. Örnekleri, oda sıcaklığında bir yörünge çubuğu (100 rpm) üzerinde 30 dakika inkübe edin. Çözünmüş proteinleri 10,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Yeni bir tüp içinde protein süpernatantı toplayın. Toplanan süpernatandan protein konsantrasyonunu belirleyin 28 . Seçilen bir protokolle 50 μg protein in-solüsyonu sindirin. Tipik olarak, Trypsin / Lys-C mix accordiKullanım kılavuzuna bakın. Sindirimden sonra, C18 aşamalı ipuçları kullanarak kütle spektrometrisinden önce peptidlerin tuzdan arındırılması gerçekleştirilir ve sindirilmiş peptitler 29 alınır. Numuneleri, bir vakum konsantratöründe ısıtmaya gerek kalmadan yaklaşık kurumaya konsantre edin. Numuneleri uygun yükleme tamponuna (örn.% 5 asetonitril,% 0.5 formik asit) yeniden askıya alın ve nano LC sistemine bağlı yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi kullanarak LC-MS / MS ile peptit karışımlarını analiz edin. NOT: Bu protokolde sunulan örnek proteomik veri setinde, Tablo 3'te açıklandığı gibi bir gradyan kullanılmıştır. Bir tam tarama (FS) ardından 15'e kadar veri bağımlılığı olan MS / MS taramasının ardından aşağıdaki parametrelere kadar bir üst 15 strateji kullanarak kütle spektrometresini ayarlayın: FS, 200-2000 m / z'lik kütle aralığındaydı 3×10 6 iyon hedef değeri ile 70.000 çözünürlük. Yüksek bağımlılıklara göre veriye bağlı MS / MS taramalarını elde edinÇarpışma ayrışması (HCD). MS / MS için hedef değerleri, maksimal iyon doldurma süresi 50 ms, bir izolasyon penceresi 4.0 m / z, normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE)% 30 ve bir doluluk oranı 1% ile 1e 5 iyonlara ayarlayın. MS / MS iyonlarını 17.500'lük bir çözünürlükte ölçün ve dinamik dışlama 60 saniyeye ayarlandı.

Representative Results

Kapsamlı çoklu omik veri setleri, kompleks biyolojik sistemleri anlamak için çok değerlidir. Başarılı bir biyolojik deney için strateji, genellikle, anlamlı bir deneysel tasarım, deney düzeneği ve performansın ardından örnek toplama, çıkarma, analitik veri toplama, ham veri işleme, istatistiksel veri analizi, ilgili metabolitin tanımlanması ve biyolojik veri yorumlamasından başlamaktadır. Yol haritası ve görselleştirme de dahil olmak üzere ( Şekil 1 ). Burada tanıtılan özütleme protokolünde, Şekil 2'deki detaylı iş akışına genel bakışta tasvir edilen örnek toplama, işleme ve çıkarma adımlarına odaklanıyoruz. Gösterim amacıyla, 50 mg Arabidopsis yaprak dokusu seçildi. Bu malzeme hasat edilmekte, öğütüldükten ve öğütülmeden önce üçÖrnek analitik UPLC-MS platformları, hedeflenmiş ve hedeflenmemiş lipidomik, metabolomik ve proteomik analiz için kullanılabilen verileri sağlar. Şekil 2 ve 6 , ek olarak, standart koşullar altında ekstraksiyon solventinin nasıl görünmesi gerektiğinin temsili resimlerini içermektedir. Buna ek olarak, aşırı miktarda çökeltilmiş makromoleküller (proteinler ve nişasta) ve uygunsuz numune homojenizasyonu olan numuneler içeren örnekler gösterilmiştir ( Şekil 3 ). Bu iki yaygın problemin gidermesi Şekil 3'de kısaca verilmekle birlikte, daha önceki yayınlarımızda da daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Şekiller 4 ve 5 , lipitten türetilen üç analitik kromatogram örneğini özetlemektedir, polar / semI-polar metabolitler ve protein analizleri. Üst MTBE fazından alınan lipitler ( Şekil 2 ), yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisiyle birleştirilmiş ters faz (RP) C8 ultra performans sıvı kromatografisi ile analiz edildi. Lipitler, pozitif ve negatif MS iyonizasyon modları ( Şekil 4 , üst bölme) kullanılarak elde edilebilir 16 , 24 . Kutupsal ve yarı polar primer ve sekonder metabolitler polar (su / metanol) fazdan ( Şekil 2 ) ters fazlı (RP) C 18 UPLC-MS 25 ile analiz edildi. Gösterilen yöntem, ters fazlı kromatografiyi kullanarak, MS'de pozitif ve negatif iyonizasyon modları kullanılarak analiz edilebilen yarı-polar metabolitlerin (yani, bitki ikincil metabolizmasından gelen metabolitler) oldukça uyumludur( Şekil 4 , alt bölme) 16 . Ters fazlı materyal üzerinde iyi bir tutuş göstermeyen bu fraksiyondan daha fazla hidrofilik metabolitler (şekerler, polar amino asitler, vs.), GC-MS 16 veya hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi 30 gibi diğer analitik yöntemlerle analiz edilebilir. Ekstraksiyon borusunun tabanındaki katı peletten alınan proteinler ( Şekil 2 ) solüsyonda sindirildi ve shot gun LC-MS ( Şekil 5 ) kullanılarak analiz edildi, nişasta ve hücre duvarı ekstraksiyon protokolü Materyal, önceden yayınlanmış protokolümüzden elde edilebilir 16 . Özetle, 200'den fazla lipid türü, 50 açıklanmış yarı-polar metabolit ve birkaç bin proteiBizim örneğimizde kullanılan türden numuneler rutin olarak tanımlanabilir. Ek olarak, yöntem farklı dokuları, organları ve hücre kültürü materyalini kullanarak geniş uygulanabilirlik gösterdi ( Şekil 6 ). Şekil 1: Büyük Ölçekli Hedefsiz Öykünme Analizi için Genel İş Akışı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 2 : Biyolojik Bir Numunenin Tek Bir Kısmından Lipidlerin, Metabolitlerin ve Proteinlerin Analizi için Örnek Hazırlama ve Çıkarma İş Akışı.Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3 : İki Fazlı Bölme Çıkarma Protokollerini Kullanan Yaygın Olarak Gözlemlenen Sorunların Açıklayıcı Örnekleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 4 : Arabidopsis thaliana Yaprak Özlerinden Lipid ve Yarı-Polar Metabolitlerin Temsilci Kromatogramları . Taban pik kromatogramı(Üst bölme) ve yarı polar metabolitler (alt bölme) pozitif iyonizasyon modunda analiz edildi 16 . Her kromatogramın sağ üst köşesindeki pasta grafikleri, farklı kimyasal sınıflara atanan belirlenmiş lipidlerin ve metabolitlerin sayısını gösterir. Chl, klorofiller; DAG, diasilgliserid; DGDG, digalaktosil-diasilgliserol; FA, yağlı asit; LizoPC, lizofosfatidilkolin; MGDG, monogalaktonuzikalgliserol; PC, fosfatidilkolin; PE, fosfatidiletanolamin; PG, fosfatidilgliserol; PI, fosfatidilinositol; PS, fosfatidilserin; SP, sfingolipid; SQDG, sülfoquinovosyildiasilgliserol; TAG, triaçilgliserid. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 5 <s Trong>: Arabidopsis thaliana Yaprak Özlerinden Peptidlerin Temsilci Zirve Pik Kromatogramı . Sağ üst köşedeki pasta grafiği, farklı biyolojik süreçlere ayrılmış tanımlanmış proteinlerin sayısını gösterir 16 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 6 : Vahşi tipli Arabidopsis thaliana'dan çeşitli doku tiplerinin Temsilci Çıkarma Örnekleri . Tüm numuneler, belirtilen dokulardan 50 mg taze ağırlık kullanılarak özümlendi."> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Zaman (dak) Tampon A'dan Tampon B'ye 0 ila 1 dakika 45% A Tampon A:% 1 İM NH4-Asetat, UPLC MS dereceli suda% 0.1 asetik asit 1 ila 4 dakika % 45 A'dan% 25 A'ya lineer gradyan Tampon B: asetonitril / izopropanol 7: 3 (v: v) içinde% 1 İM NH4-Asetat,% 0.1 asetik asit, 4 ila 12 dakika % 25 A'dan% 11 A'ya lineer gradyan Akış hızı 400 μL / dak 12 ila 15 dakika % 11 A'dan% 0 A'ya doğrusal gradyan Enjeksiyon hacmi 2 μL 15 ila 19,5 dak. Kolonu,% 0 A ile 4,5 dakika boyunca yıkayın. <Td> 19.50 ila 19.51 dakika % 45 A'ya geri dönün 19.51 ila 24 dakika % 45 A ile dengeye getirin Tablo 1: Lipidlerin RP-UPLC Ayrılması İçin Grade Parametreleri. RP, ters faz. UPLC, ultra-performans sıvı kromatografisi. Zaman (dak) Tampon A'dan Tampon B'ye 0 ila 1 dakika % 99 A Tampon A: UPLC dereceli suda% 0.1 formik asit 1 ila 11 dakika % 99 A'dan% 60 A'ya lineer gradyan Tampon B: UPLC grad asetonitril içinde% 0.1 formik asit 11 ila 13 dakika % 60 A'dan% 30 A'ya lineer gradyan Debi 4001 L / dakika 13 ila 15 dakika % 30 A'dan% 1 A'ya doğrusal gradyan Enjeksiyon hacmi 2 μL 15 ila 16 dakika Kolonu% 1 A ile 1 dakika boyunca yıkayın. 16 ila 17 dakika Lineer gradyan,% 1 A ila% 99 A 17 ila 20 dakika % 99 A'da 3 dakika dengelenir. Tablo 2: Polar ve Yarı-Polar Metabolitlerin RP-UPLC Ayrımı İçin Gradyan Parametreleri. RP, ters faz. UPLC, ultra-performans sıvı kromatografisi. Zaman (dak) Tampon B'den Tampon A'ya 0 ila 5 dakika % 0 ila% 10 doğrusal gradyan Tampon A: UPLC dereceli suda% 0.1 formik asit 5 ila 80 dakika % 10'dan% 40'a lineer gradyan Tampon B:% 60 UPLC dereceli asetonitril içinde% 0.1 formik asit 80 ila 85 dakika % 40'dan% 60'a lineer gradyan Akış hızı 300 nL / dak 85 ila 86 dakika % 60'dan% 95'e lineer gradyan Enjeksiyon hacmi 5 μL 86 ila 91 dakika Kolonu 5 dakika boyunca% 95 91 ila 92 dakika % 95'den% 0'a lineer gradyan 93 ila 110 dakika Kolonu 17 dakika süreyle% 0'da dengeye getirin Tablo 3: Peptidlerin Nano-LC Ayırımı İçin Grade Parametreleri. LC, sıvı kromatografisi.

Discussion

Bu yazıda, tek bir 50 mg yaprak örneğinden kapsamlı lipidomik, metabolomik ve proteomik analiz için basit ve son derece uygulanabilir bir ekstraksiyon protokolü anlatılıyor ve gösteriliyoruz. Yöntem, çeşitli makalelerde 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37'de yayınlanan çeşitli çalışmalarda daha önce kullanılmıştır Ve kanıtladı, düz ileri yanı sıraIş akışı ve yüksek uygulanabilirlik özelliklerinin sağlam ve tekrarlanabilir olması.

Burada verilen uygulamalar karmaşık biyolojik bir numunenin başlangıç ​​taraması için bazı rutin yöntemler göstermektedir. Bu gösterilen büyük ölçekli metabolomik ve lipidomik veri setleri, analiz edilen biyolojik sistemin metabolizmasındaki geniş veya spesifik değişiklikler hakkında kapsamlı bilgi sağlayabilirken, proteinlerin analizinden elde edilen veriler, nicel (bolluk) ve nitel (modifikasyonlar ) Hücresel fonksiyonları ve makinaları kontrol eden enzimlerin, yapısal proteinlerin veya transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) değişimi. Buna göre, bütünleyici omik veri, spesifik metabolik yollar veya hücresel süreçlerle ilişkili çeşitli moleküllerin moleküler değişimlerini aydınlatarak, biyolojik bir sistemin genetik veya biyotik ve / veya abiyotik bozulmalarının yol açtığı olası değişiklikler hakkında ilk bilgileri ortaya koyma potansiyeline sahiptir.

Tabii ki, Başarılı bir sistem biyolojisi analizi için uzun vadede, analiz edilmiş ve açıklanan moleküler varlıkların sayısını en üst düzeye çıkarmak, hücresel işlevleri ve etkinlikleri mümkün olduğunca izlemek için oldukça şarttır. Bu amaçla, elde edilen fraksiyonlar, ilave bileşikleri veya bileşik sınıfları hedefleyen çeşitli analitik yöntemlere ilave olarak uygulanabilir ( Şekil 4 ).

Bunu söyleyince, elde edilen verilerin küresel analiz stratejisinin iki farklı stratejiyle takip edilebileceği belirtilmelidir: Bir yandan bilinen bileşimlerin nicelenmesi ile hücresel işlevlerin aydınlatılmasına vurgu yapıyoruz. Öte yandan, ölçülen metabolitlerin ve lipidlerin birçoğu henüz bilinmiyor veya ek açıklanmıyor. Bu henüz açıklanmayan bileşik ölçümler, aynı zamanda, istatistiksel yöntemlerle sınıflandırma veya ayrımcılık için kullanılabilen, bol miktarda anlamlı bilgi içermektedir. BEtween gruplar veya tedaviler 20 , 21 , 22 .

Yine de, bu bilinmeyen bileşikler, özellikle de grup sınıflamasıyla veya biyolojik belirteç olarak hizmet eden bileşikler tanımlanmalıdır. Bu tanımlama işlemi ne yazık ki oldukça sıkıcıdır ve ilave analitik ölçümler veya stratejiler olmadan başarılamaz.38 Şekil 4'te görüldüğü gibi, açıklanmayan bileşikler sayısı oldukça fazladır (aslında büyük çoğunluk). Bununla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi, bu kromatografik tepeler veri analizi kapsamında ele alınabilir ve bu nedenle önemli ölçüde etkilenen varlıklar aydınlatılabilir ve başka tanımlama stratejilerine tabi tutulabilir.

Özetle, burada sunulan protokolün deneysel sistemler biyolojisinin yanı sıra klasik istatistiksel uygulama için birçok avantaj sağladığı sonucuna varabilirizations.

Birincisi, tüm fraksiyonlar tek bir numuneden çıkarıldığından, farklı deneysel veri setleri (lipidler, metabolitler, proteinler) arasındaki varyasyon, her veri seti aynı numune alikotundan türetildiğinden önemli ölçüde azaltılır. Bu açıkça, elde edilen sonuçların karşılaştırılabilirliğinin artmasına yol açmaktadır.

İkincisi, yöntem kolaylıkla ölçeklendirilebilir ve bu nedenle, küçükten büyük numune miktarlarıyla son derece uyumlu hale getiriyor. Düzenli olarak 10-100 mg doku örnekleri kullanıyoruz, ancak başarıyla gerçekleştirilen lipidomik çalışmalar, az 20 Arabidopsis tohumunda gerçekleştirildi 31 . Özellikle küçük numune miktarlarıyla uyumluluk, sınırlı miktarda biyolojik doku veya numune varsa bu yöntemi uygun kılar. Yine de, yeterli numune materyali mevcut olsa bile, burada sunulan metot, bu numuneleri, u yerine çok sayıda deneysel kopyada kullanmak için avantaj sağlamaktadırFarklı çıkarma prosedürleri için onları söyle. Bu, daha iyi ve rafine edilmiş istatistiksel veri analizine olanak tanır.

Üçüncüsü, bu yöntem kutupsal ve polar olmayan moleküllerin sıvı-sıvı fraksiyonlamaya dayandığı için, basit tek fazlı özütleme yöntemlerinin ( örn., Metanol ekstraksiyonları) aksine, prosedürde önemli bir de-kompleksleştirme basamağı sağlar. Bu etkin örnek de-komplike etme, kimyasal olarak birbirine karışan moleküllerin birbirlerinden ayrılmasından ötürü, ayrı fraksiyonların kısmen saflaştırılmasına yol açar. Buna göre, kimyasal ayırma işlemi, ayıklanan numunelerin sistematik olarak farklı kimyasal sınıflara ayrılması için pratik bir avantaj sağlamakla kalmayıp aynı zamanda, kirletici bileşikleri farklı fraksiyonlardan uzaklaştırdığı için bireysel analitik ölçümleri de geliştirir. Açıkçası, özellikle organik faza bölünmüş ve çoğunlukla olumsuz olarak etkileyen lipidlerinPolar bileşiklerin kromatografik analizi, polar fraksiyonda neredeyse tamamen yok olacaktır. Aynı şey kutupsal bileşiklerden yoksun olacak olan hidrofobik lipidlerin analizi için de geçerlidir. Polar ve nonpolar bileşiklerin birbirlerinden arındırılmasının yanı sıra protein, nişasta ve hücre duvar analizi için kullanılabilecek ayrı bir fraksiyon sağlamakla kalmayıp aynı zamanda protein ve diğer makro molekülleri de örnekten tüketiriz. Bireysel fraksiyonlarda daha temiz bir numuneye yol açar. Bilhassa, büyük makromoleküllerin varlığının, analitik kolonların hasar görmesine veya en azından daha kısa bir ömrüne neden olduğu biliniyorsa, bu özellikle önemlidir.

Daha az tehlikeli ve daha elverişli olan kloroform replasman solventi 15'e dayanan tarif edilen MTBE ekstraksiyon yöntemi, grubumuzdan birkaç çalışma ile gösterilmiş olup, yaygın olarak applBitkiler 16 , algler 17 , 18 , sinekler 19'dan farklı biyolojik numuneler için buzlanabilirlik, aynı zamanda birkaç memeli doku, organ veya hücre 20 , 21 , 22 .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MS, GERLS-DAAD programından tam bir doktora bursu ile desteklenmektedir. Makale üzerindeki kanıtı okumak ve yorumlamak için Dr. Andrew Wiszniewski'ye teşekkür etmek istiyoruz. Yardımları için Almanya'nın Golm şehrindeki Max-Planck Moleküler Bitki Fizyolojisi Enstitüsündeki Giavalisco laboratuvarının tüm üyelerine çok minnettarız.

Materials

Reagents and standards
Ampicillin  Sigma Aldrich A9393-5G Internal standard for metabolites
Corticosterone  Sigma Aldrich 27840-500MG Internal standard for metabolites, HPLC grade
13C Sorbitol Sigma Aldrich 605514 Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)  Avanti Polar Lipids 850360P Internal standard for lipids
Methanol (MeOH)  Biosolve Chemicals 13684102 ULC-MS grade
Water Biosolve Chemicals 23214102 ULC-MS grade
Methyl tert-butyl ether (MTBE)  Biosolve Chemicals 13890602 HPLC grade
Trypsin/Lys-C mix  Promega V5072 Enzymatic digestion of proteins
Equipment
Balance  Sartorius Corporation  14 557 572
Tissue grinding mixer mill  Retsch, Mixer Mill MM 300 20.746.0001
Mortar and pestle  Sigma Aldrich Z247464-1EA
Vortex mixer  Vortex-Genie 2, Model G560 SI-0236
Vacuum concentrator Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators 7.008.500.002
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes  Eppendorf 30120094 Used for sample extarction
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes  Eppendorf 30120086 Used for fractions
Shaker Eppendorf Thermomixer 5436 2050-100-05
Sonicator  USC 300 TH 142-0084
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf, model 5427R 22620701
UPLC system  Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)
 MS system  Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany).
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) Waters, Machester, UK 186002878 Analysis of lipids
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles)  Waters, Machester, UK 186003539 Analysis of metabolites
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system  Thermo-Fisher, Bremen, Germany Analysis of peptides
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
  2. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  3. Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, 1 (2014).
  4. Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
  5. Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
  6. Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
  7. Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
  8. Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool (“metabolome”) analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
  9. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
  10. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
  11. Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
  12. Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
  13. Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
  14. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
  15. Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
  16. Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
  17. Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
  18. Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
  19. Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  20. Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
  21. Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584 (2014).
  22. Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871 (2014).
  23. Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
  24. Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54 (2011).
  25. Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
  26. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
  27. Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
  28. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  29. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  30. Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
  31. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  32. Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
  33. Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
  34. Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
  35. Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
  36. Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
  37. Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053 (2015).
  38. Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).

Tags

Fractionated ExtractionMetabolitesLipidsProteinsSingle SampleMTBE ExtractionMultiomics AnalysisArabidopsisSample Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. J. Vis. Exp. (124), e55802, doi:10.3791/55802 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image