שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד
Summary
פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.
Abstract
הבנה של מערכות ביולוגיות מורכבות דורשת מדידה, ניתוח ואינטגרציה של מערכים מורכבים מרובים של התא החי, הנקבעת בדרך כלל על ידי מדידות תמליליות, פרוטאומיות, מטבוליות וליפידומיות. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה פשוטה עבור מיצוי לשחזור של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות aliquot אחד לכל מדגם. שיטת החילוץ מבוססת על אתר מתיל-בוטל אתר: מתנול: מערכת מים לנוזל: מחיצות נוזלי של מטבוליטים הידרופובי וקוטב לשני שלבים בלתי ניתנים לזיהום יחד עם משקעים של חלבונים מקרומולקולות אחרות כמו גלולה מוצק. שיטה זו, אם כן, מספקת שלושה שברים שונים של הרכב מולקולרי ספציפי, אשר תואם באופן מלא עם תפוקה משותפת גבוהה "טכנולוגיות" אומיקס כגון כרומטוגרפיה נוזלית (LC) או כרומטוגרפיה גז (GC) מצמידים ספקטרומטרים המונית. למרות שהשיטה היתה יוזמהΑ שפותחה עבור ניתוח של דגימות רקמות צמח שונות, היא הוכיחה להיות תואם באופן מלא להפקת וניתוח של דגימות ביולוגיות ממערכות מגוונות כמו אצות, חרקים, רקמות יונקים ותרבויות תאים.
Introduction
ביולוגיה של מערכות, אשר צמחה באמצע המאה הקודמת 1 והתקדם על ידי ניתוח בקנה מידה גדול של נתונים גנומיים transcriptomic נתונים 2 , 3 , פיתחה לגישה חדשה חיונית לניתוח של מערכות ביולוגיות מורכבות 4 , 5 . המטרה העיקרית של ביולוגיה של מערכות היא לפענח את האינטראקציות של המרכיבים והתלות במערכות הביולוגיות ולגשר על הקשר בין גנוטיפים, מימושם, התמורות המולקולריות והפנוטיפים המתקבלים. לפיכך, שילובם של מערכי נתונים מקיפים, שיוצרו על ידי גישות אנליטיות שונות, כגון גנומיקה, תעתיק, מטבוליומיקה, ליפידומיקה ופרוטומיקה והניתוח החישובי שלהם, הפכו לתנאי מוקדם לתיאור ולהבנה של מערכות ביולוגיות מורכבות.
בס על המגוון הכימי העצום והמורכבות של מרכיבים ביולוגיים בכל מערכת חיים, הייצור של נתונים גדולים ומקיפים של 'אומיקס' מסתמך במידה רבה על איכות שיטת החילוץ המיושמת 9 . בנוסף לאיכות שיטת החילוץ, כלכלת השיטה חשובה; זה אומר שזה יהיה רצוי להשיג מידע מולקולרי כמו כמה קלט מדגם קטן ככל האפשר. לעתים קרובות, כמויות מדגם יכולות להיות מגבילות ולכן רצוי מאוד להשתמש בשיטת מיצוי, אשר יכולה להפיק כמו כיתות מולקולריות רבות מתוך מיצוי יחיד של מדגם נתון. משמעות הדבר היא שבמקום להשתמש במספר שיטות מיצוי מיוחדות להפקת מערכים מורכבים שונים מאלוקים מדגמים שונים של אותו מדגם, נעשה שימוש בשיטת מיצוי רציף, אשר מפצלת את המרכיבים המולקולריים של aliquot יחיד לשברים מולקולריים שונים.
_content "> השיטה הנפוצה המשמשת לשיטות חלוקה מפוצלות אלה מבוססת על שיטת הפקת השומנים דו-פאזית מ- Folch et al שפותחה בשנת 1957 10. שיטה זו מבוססת על כלורופורם: מחיצות מתנול / מים של מטבוליטים קוטביים והידרופובים שנועדו לנקות ולדגימה de-complex עבור ניתוח ליפידים באיכות גבוהה.עם התפתחות רב של מערכות ביולוגיה אומיקס, שיטת Folch היה עוד, צעד, משופרת על ידי ניצול זה עבור מחיצת המדגם של חלבונים מטבוליטים קוטב ושומנים עבור גז, נוזלים מבוססי כרומטוגרפיה מטבולית וליפידומיה של תרכובות קוטב הידרופובי, בנוסף פרוטאומטי נוזלי מבוססי כרומטוגרפיה 11 , 12 , 13 , 14. למרבה הצער, כל השיטות הללו מסתמכים על שיטת מיצוי המבוססת על כלורופורם, אשר לא רק מוביל לא רצויRmation של גלולה חלבון כמו interfase בין הקוטב לבין השלב בשלב, אבל הוא גם ממס בלתי רצוי מנקודת מבט כימיה ירוקה 15 , 16 . עם זאת, מתיל המיל טרט בוטיל אתר (MTBE) מתגבר על שתי הבעיות הנ"ל והוא תחליף מתאים כלורופורם. בהתאם לדרישות אלו, החלטנו להקים שיטת מיצוי המבוססת על מים המבוססת על מתנול: MTBE, אשר ממלאת את כל המפרטים הנ"ל ולכן פועלת כנקודת מוצא אידיאלית לניתוח רב-אומני מקיף.פרוטוקול זה מנחה את המשתמש צעד אחר צעד באמצעות זרימת עבודה פשוטה, מהירה לשחזור של הכנת המדגם, כולל פתרון בעיות של בעיות שנצפו בדרך כלל. יתר על כן, נביא בקצרה נתונים אנליטיים למופת של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-עלית (UPLC-MS)Lipidomics אד, metabolomics ו proteomics פרופיל מ דגימת רקמת הצמח. למרות הדוגמאות הנתונות נגזרים מ 50 מ"ג של דגימת רקמה ארבידופסיס thaliana עלה, פרוטוקול זה שימש במשך כמה דגימות ביולוגיות אחרות רקמות, כולל אצות 17 , 18 , חרקים 19 ותאי יונקים, איברים ורקמות 20 , 21 , 22 . היקף פרוטוקול החילוץ המוצג הוא לספק תיאור ברור ומפורט של טרום הדגימה טיפול מדגם הליך החילוץ עצמו. למרות שאנו מספקים שלוש דוגמאות קצרות של היישום האנליטי, מידע מפורט על הטיפול טרום ואחרי נתונים אנליטי ניתן לקבל מן הפרסומים הקודמים שלנו 16 , 23 , 24 , <supClass = "xref"> 25 , 26 .
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה אנו מתארים וממחישים פרוטוקול מיצוי פשוט ויישומי מאוד לניתוח ליפידומי, מטבולומי ופרוטומטי מקיף מדגם עלה בודד של 50 מ"ג. השיטה שימשה בעבר במספר מחקרים, שפורסמו בכתבות מגוונות 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 והוכיח, בנוסף ישר קדימה שלהזרימת עבודה וישימות גבוהה להיות חזקים לשחזור.
כאן סיפקה יישומים להראות כמה שיטות שגרתיות עבור ההקרנה הראשונית של מדגם ביולוגי מורכב. אלה נתונים בקנה מידה גדול metabolomic ו lipidomic ערכות נתונים יכולים לספק מידע מקיף על השינויים רחב או ספציפי של מטבוליזם של המערכת הביולוגית ניתח, בעוד הנתונים המתקבלים מניתוח של חלבונים, מספק תובנות כמותית (שפע) ואיכותי (שינויים ) שינויים של אנזימים, חלבונים מבניים או גורמי שעתוק (TFs) השולטים בפונקציות הסלולר ובמכונות. בהתאם לכך, לנתוני אומיקס אינטגרטיביים יש פוטנציאל לחשוף מידע ראשוני על שינויים אפשריים הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או ביוטיות ו / או אביוטי של מערכת ביולוגית, על ידי הבהרת שינויים מולקולריים של מולקולות מגוונות הקשורים מסלולים מטבוליים ספציפיים או תהליכים תאיים.
כמובן, בטווח הארוך, זה חיוני למדי, עבור ניתוח מוצלח של ביולוגיה מערכות, על מנת למקסם את מספר גופים מולקולריים נותחו ומורשים, המאפשר ניטור של פונקציות ופעילויות סלולריות באופן מלא ככל האפשר. לשם כך, השברים שהתקבלו ניתן ליישם בנוסף שיטות אנליטיות מגוונות, מיקוד תרכובות נוספות או כיתות מתחם ( איור 4 ).
עם זאת, יש לציין כי אסטרטגיית הניתוח הגלובלית של הנתונים המתקבלים יכולה להיות בעקבות שתי אסטרטגיות שונות: מצד אחד, אנו מדגישים את ההבהרה של פונקציות הסלולר על ידי כימות של תרכובות ידועות. מצד שני, רבים של מטבוליטים שנמדדו ושומנים עדיין לא ידוע או ביאורים. אלה, עדיין, ללא שם לב מדידות מורכבות מכילים גם שפע של מידע משמעותי, אשר, ניתן להשתמש בשיטות סטטיסטיות עבור סיווג או אפליה בבין קבוצות או טיפולים 20 , 21 , 22 .
עם זאת, אלה compounds ידוע, במיוחד אלה רלוונטיים עבור סיווג קבוצה או לשמש biomarkers צריך להיות מזוהה. תהליך זיהוי זה הוא למרבה הצער די משעמם ולא ניתן להשיג ללא מדידות אנליטיות נוספות או אסטרטגיות 38 . כפי שניתן לראות בתרשים 4 , מספר התרכובות הלא-מסובכות גבוה למדי (למעשה הרוב המכריע). עם זאת, כאמור לעיל, פסגות כרומטוגרפיות אלה יכולות להיות מטופלות במסגרת ניתוח הנתונים, ולכן ניתן להשפיע על הגורמים המשפיעים באופן משמעותי על הישויות ועל מנת לעמוד באסטרטגיות זיהוי נוספות.
לסיכום, אנו יכולים להסיק כי כאן הציג פרוטוקול מספק מספר יתרונות עבור מערכות ביולוגיה ניסיונית כמו גם עבור יישום סטטיסטי קלאסיAtions.
ראשית, מאחר שכל השברים מופקים ממדגם יחיד, השונות בין נתוני הניסוי השונים (ליפידים, מטבוליטים, חלבונים) מופחתת באופן משמעותי, שכן כל קבוצת נתונים נגזרת מאותו אלכוה מדגם. זה בבירור מוביל להשוות מוגברת של התוצאות שהתקבלו.
שנית, השיטה היא מדרגית בקלות עושה את זה ולכן תואם מאוד עם סכומים מדגם קטן עד גדול. אנו משתמשים באופן שגרתי 10-100 מ"ג של דגימות רקמה, אך מחקרים מוצקים ליפידומית בוצעו גם על כ 20 זרעים ארבידופסיס 31 . במיוחד תאימות עם כמויות מדגם קטן עושה את השיטה החלה אם כמויות מוגבלות של רקמות ביולוגיות או דגימות זמינים. ובכל זאת, גם אם מספיק חומר מדגם זמין, השיטה המוצגת כאן מציעה את היתרון לנצל דגימות אלה במספר גדול יותר של משכפל ניסיוני במקום uלשיר אותם עבור הליכי מיצוי שונים. זה מאפשר ניתוח נתונים סטטיסטיים טובים יותר מעודן.
שלישית, מאחר שהשיטה מתבססת על חלוקה נוזלית-נוזלית של מולקולות קוטביות ולא קוטביות, היא מספקת, להבדיל משיטות מיצוי פשוטות חד-פאזיות ( למשל, תמציות מתנול) צעד משמעותי דה-מסובך בהליך. זה יעיל מדגם דה מורכבות מוביל טיהור חלקי של שברים בודדים עקב ההפרדה של מולקולות מפריעות כימית אחד מהשני. לפיכך, תהליך החלוקה הכימית לא רק מספק יתרון מעשי עבור aliquoting שיטתי של דגימות חילוץ לתוך כיתות כימיים שונים, אלא גם משפר את המדידות האנליטיות הפרט, שכן הוא מסיר תרכובות מזהמים מן שברים שונים. ברור, אנו יכולים להבחין כי במיוחד את השומנים, אשר מחולקים לשלב אורגני אשר בדרך כלל להשפיע לרעה עלאנליזה כרומטוגרפית של תרכובות קוטביות, תיעלם כמעט לחלוטין משבריר הקוטב. הדבר נכון גם לניתוח של שומנים הידרופובי, אשר יהיה מדולדל של תרכובות הקוטב. מלבד הטיהור של תרכובות קוטביות ולא קוטביות זה מזה, אנו לרוקן ולאסוף חלבונים ומולקולות מקרו אחרות מן המדגם, אשר לא רק מספק חלק נפרד, אשר יכול להיות מנוצל עבור חלבון, עמילן וניתוח קיר התא 16 , אלא גם מוביל מדגם נקי בתוך שברים בודדים. זה רלוונטי במיוחד, שכן ידוע כי נוכחות של מקרומולקולות גדולות, מוביל נזק או לפחות חיים קצרים יותר של העמודות האנליטיות.
ואחרון חביב, שיטת החילוץ MTBE המתואר, אשר מסתמך על מסוכן פחות וחסכוני יותר החלפת כלורופורם ממס 15 , כבר הוצגו על ידי מספר מחקרים מהקבוצה שלנו, להיות appl applIcibility עבור דגימות ביולוגיות שונות מן הצמחים 16 , אצות 17 , 18 , זבובים 19, אלא גם כמה רקמות יונקים, איברים או תאים 20 , 21 , 22 .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS נתמך על ידי מלגה מלאה דוקטורט מתוכנית GERLS-DAAD. ברצוננו להודות ד"ר אנדרו Wiszniewski עבור הוכחה קריאה והערות על כתב היד. אנו אסירי תודה לכל חברי המעבדה Giavelisco במכון מקס פלנק של פיזיולוגיה הצמח מולקולרית, Golm, גרמניה על עזרתם.
Materials
| Reagents and standards | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Equipment | |||
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
| Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides | |
References
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, 1 (2014).
- Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
- Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
- Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
- Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
- Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool (“metabolome”) analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
- Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
- Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
- Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871 (2014).
- Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053 (2015).
- Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).
