In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Insuficiência cardíaca congestiva (ICC) persiste como das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. CHF ocorre frequentemente após a perda maciça de cardiomyocytes e o desenvolvimento do tecido de cicatriz sem célula como resultado patológico de um infarto do miocárdio (MI)¹. Enquanto o coração é um órgão parcialmente auto renovadora, a residente tronco progenitoras célula piscina e responsável pela execução de regeneração tecidual significativamente diminui em abundância e função em pacientes idosos, muitas vezes tornando-se insuficiente para a recuperação ideal após a lesão. Assim, há grande interesse no desenvolvimento de tratamentos experimentais que envolvem o transplante de células de doadores saudáveis para o miocárdio danificado. É imperativo que as células do doador não só restaurar a estrutura do tecido, mas também alcançar a recuperação funcional do miocárdio afetado.

O coração nativo emprega coração tecido-residente e endógenas células-tronco da medula óssea-originou para pós-lesão reparar^2,3,4. Regenerativa células-host e doador derivada de iguais, deve ter a capacidade de obter o fenótipo apropriado e a função do microambiente do miocárdio remodelação, juntamente com a capacidade de forma eficiente e segura a substituir as células perdidas. Métodos de diferenciação in vitro têm sido amplamente utilizados para alcançar alta eficiência, com base em células estaminais casos produção^5,6. O perfil de expressão de marcadores de linhagem cardíaca é usado para definir o processo de diferenciação de células-tronco para a linhagem cardíaca⁷. Início diferenciação marcadores, tais como NKX2.5, factor potenciador de miócito 2C (Mef2c) e GATA4^8,9, podem ser uma indicação do início do processo de cardiomyogenic. Marcadores de casos maduro, comumente usados para avaliar a eficácia de diferenciação são sinal proteína reguladora α (SIRPA)¹⁰, troponina cardíaca T (miocardite)¹¹, cadeia pesada miosina cardíaca (MYH6)^8,12,13e connexin 43 (Cx43)^14,15,16. Os métodos usando células-tronco embrionárias (CES) e as células-tronco pluripotentes (EPS) foram cuidadosamente otimizados e discutidos sobre os detalhes de fatores indutivos, oxigênio e nutrientes gradientes e o momento exato da ação^5,6,7,17,18. No entanto, ESC e PSC-com base em tecnologias ainda apresentam várias preocupações éticas e de segurança, juntamente com características eletrofisiológicas e imunológicos suboptimal^19,20. Hosts transplantados com estas células frequentemente experimentam immunorejection e requerem imunossupressão permanente. Isto é principalmente devido ao descasamento de histocompatibilidade (MHC) as moléculas complexas no host e o doador e o resultante de resposta de células T²¹. Enquanto indivíduo MHC classe I de correspondência é uma solução possível, uma prática clínica mais acessível exigiria uma fonte de celular que é universalmente immunoprivileged superar a preocupação de rejeição.

Como uma fonte alternativa de células para uso em aplicações clínicas, MSCs e em particular, BMSCs, têm sido investigados para uso na regeneração de tecidos desde sua descrição inicial em 1995²². MSCs são acreditados para ser residentes células regenerativas que podem ser encontradas em quase qualquer tecido vascularizado²³. Após o isolamento da fonte desejada, MSCs podem facilmente ser expandidos na cultura, têm capacidade extensa parácrina e frequentemente possuem immunoprivileged ou imunomoduladores propriedades^24,25. Sua segurança e eficácia já foram mostrados em diversos estudos pré-clínicos, em particular para regeneração cardíaca^3,26.

Muitas estratégias de diferenciação de MSC utilizam agentes farmacológicos, tais como azacytidine 5²² e DMSO²⁷e crescimento ou fatores morphogenic, BMPs^5,7,28,29 ou da angiotensina-II³⁰, com eficiência variável. Estas estratégias, no entanto, não se baseiam os obstáculos que um celular regenerativa ingênuo é provável encontrar depois de hospedagens ou sendo entregue para o local da lesão in vivo. Estratégias mais fisiologicamente relevantes, embora mais difícil de definir e manipular, baseiam-se na premissa de que a diferenciação de MSC pode ser induzida através de sinais do microambiente do tecido em si. Estudos anteriores mostraram que a exposição à célula cardíaca lysates³¹ ou^32,de miocárdio ventricular³³, ou direto contato com cardiomyocytes primária em vitro^15,34, pode aumentar a expressão dos marcadores cardíacos no MSCs. Outros demonstraram cardiomyogenesis espontânea após o tratamento de lesões cardíacas com MSCs^35,36,37,38, embora em parte, a fusão de BMSCs e cardiomyocytes^39,40 gerado o miocárdio nascente. A nosso conhecimento, funcionais, espontaneamente contratantes cardiomyocytes do MSCs humanas (hMSCs) de qualquer fonte de tecidos ainda não foram relatados.

O consenso atual é que todos os MSCs surgem a partir de células perivasculares²³. Young MSCs com Pericito propriedades podem ser isolados da região perivascular de^4342,41,do tecido humano do cordão umbilical. Em comparação com BMSCs, HUCPVCs possuem potencial maior diferenciação e várias outras vantagens regenerativas, ambos em vitro^41,44 e na vivo^45,46,47. Notavelmente, a fonte, sendo a interface materno-fetal, HUCPVCs têm significativamente mais baixa imunogenicidade em comparação com adultas fontes do MSCs. Nossa pesquisa centra-se na caracterização e aplicações pré-clínicas de FTM HUCPVCs, a mais nova fonte de MSCs investigados, que mostramos anteriormente ter aumentado multilineage proliferativa e maior capacidade de diferenciação, incluindo a linhagem de cardiomyogenic⁴¹.

Aqui, apresentamos um protocolo que combina a formação de agregados e camadas de alimentador primário de células cardíacas como indutivas forças para alcançar a diferenciação de cardiomyogenic completa de MSCs. agregados fornecem um ambiente 3D, que modela melhor condições em vivo em comparação com as culturas aderentes 2D. Utilizar camadas cardíacas alimentador fornece um ambiente que é representante do site do transplante final para os MSCs. Demonstramos que fontes mais jovens de MSCs isoladas de cordões umbilicais de pré ou pós-natal têm uma maior capacidade para agregados de forma e atingir o fenótipo cardíaco em comparação com BMSCs adultos, mantendo ainda o seu privilégio imunológico. Além da elevação íngreme de genes marcadores de linhagem cardíaca e a expressão induzida de intracelular (i.e., miocardite e MYH6) e as proteínas da pilha-superfície (i.e., SIRPA e Cx43) específicos para cardiomyocytes, mostramos que o potencial de diferenciação da FTM HUCPVCs pode ser aproveitado com esse método e que eles podem dar origem a contratantes espontaneamente células casos.