JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

Published: August 09, 2017
doi:
10.3791/55757
, , ,
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology,University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology,University of Toronto, 4Department of Physiology,University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology,Women’s College Hospital

Summary

هنا، فإننا نقدم أسلوباً لكفاءة الاستفادة من إمكانات التمايز القلب الشباب مصادر الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية بغية توليد خلايا وظيفية، المتعاقدة، مثل كارديوميوسيتي في المختبر.

Abstract

احتشاء عضلة القلب وتتالي الدماغية اللاحقة يؤدي إلى خسائر كبيرة في cardiomyocytes، مما يؤدي إلى فشل القلب الاحتقاني، السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم. الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) خيار واعدة للعلاجات المستندة إلى خلية ليحل محل التقنيات الحالية، والغازية. MSCs يمكن أن تفرق في الأنساب الوسيطة، بما في ذلك أنواع خلايا القلب، ولكن كاملة التمايز إلى خلايا وظيفية لم يتحقق حتى الآن. تستند الأساليب السابقة للتمييز بين وكلاء الدوائية أو عوامل النمو. ومع ذلك، أيضا تمكين الاستراتيجيات ذات الصلة أكثر فسيولوجيا MSCs على الخضوع للتحول كارديوميوجينيك. نقدم هنا، أسلوب تمايز استخدام المجاميع ماجستير في كارديوميوسيتي تغذية الطبقات لإنتاج خلايا المتعاقدة مثل كارديوميوسيتي.

الحبل السري البشري ارتشاح الخلايا (هوكبفكس) تبين أن يكون تفريق أكبر محتملة من التحقيق عادة أنواع لجنة السلامة البحرية، مثل نخاع العظم MSCs (بمسكس). كمصدر أونتوجينيتيكالي أصغر، نحن التحقيق في إمكانية كارديوميوجينيك من هوكبفكس (FTM) الاثلوث الأول مقارنة بالمصادر القديمة. هوكبفكس FTM هي مصدر الرواية، غنية من MSCs التي تحتفظ في الرحم إيمونوبريفيليجيد خصائصها عند مثقف في المختبر. استخدام هذا البروتوكول التمايز و FTM ومصطلح هوكبفكس تحقيق التمايز كارديوميوجينيك زيادة كبيرة بالمقارنة مع بمسكس، كما يتضح من زيادة التعبير عن علامات كارديوميوسيتي (عامل محسن ميوسيتيأي، ج 2، القلب تروبونين تي وسلسلة ثقيلة القلب الميوسين، إشارة α البروتين التنظيمي وكونيكسين 43). وأكدوا أيضا الاستمناع أقل بكثير، كما ثبت بانخفاض هلا-بالتعبير والتعبير هلا-ز أعلى. تطبيق التمايز القائم على التجميع، أظهر هوكبفكس FTM تشكيل إجمالي الزيادة المحتملة وولدت المتعاقدة كتل الخلايا ضمن أسبوع الثقافة المشارك في طبقات تغذية القلب، ليصبح أول نوع لجنة السلامة البحرية للقيام بذلك.

نتائجنا تثبت أن هذا التمايز استراتيجية يمكن فعالية تسخير إمكانات كارديوميوجينيك MSCs الشباب، مثل هوكبفكس FTM، ويوحي بأن في المختبر قبل المفاضلة يمكن أن تكون استراتيجية محتملة لزيادة على فعالية التجدد في فيفو.

Introduction

فشل القلب الاحتقاني (CHF) ما زال قائما كسبب رئيسي للإصابة بالأمراض والوفيات في جميع أنحاء العالم. وكثيراً ما يحدث فرنك سويسري عقب الخسارة الهائلة في cardiomyocytes وتطوير ندبا خالية من الخلية نتيجة مرضية ل احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن)1. بينما القلب جهاز جزئيا تجديد ذاتي، يقلل المقيم الجذعية والسلف خلية المسبح المسؤولة عن تنفيذ تجديد الأنسجة إلى حد كبير في وفرة ووظيفتها في المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين، غالباً ما تصبح غير كافية للاسترداد الأمثل بعد الإصابة. وهكذا، هناك اهتمام كبير في تطوير العلاجات التجريبية التي تنطوي على زرع خلايا صحية من الجهات المانحة في عضلة القلب التالفة. من المحتم أن الخلايا المانحة ليس فقط استعادة هيكل الأنسجة، ولكن أيضا تحقيق الانتعاش الوظيفية لعضلة القلب المتضررة.

قلب الأم توظف المقيمين أنسجة القلب والخلايا الجذعية نخاع العظام نشأت الذاتية للإصابة بعد إصلاح2،،من34. التجدد تستمد الخلايا المضيفة والجهات المانحة على حد سواء يجب أن تملك القدرة على الحصول على النمط الظاهري المناسب والدالة في المكروية لعضلة القلب يعيد البناء، جنبا إلى جنب مع القدرة على كفاءة وأمان تحل محل الخلايا المفقودة. وقد استخدمت أساليب المفاضلة في المختبر على نطاق واسع لتحقيق كارديوميوسيتي ذات الكفاءة العالية، ويستند إلى الخلية الجذعية إنتاج5،6. التشكيل الجانبي للتعبير من علامات النسب القلب يستخدم لتعريف عملية تمايز الخلايا الجذعية نحو النسب القلب7. أوائل التمايز علامات، مثل NKX2.5، ميوسيتي محسن عامل ج 2 (Mef2c)، و8،GATA49، يمكن أن يكون مؤشرا على بدء عملية كارديوميوجينيك. علامات كارديوميوسيتي الناضجة تستخدم عادة لتقييم فعالية التمايز هي إشارة البروتين التنظيمي α (سيربا)10القلب تروبونين تي (كتنت)11، وسلسلة ثقيلة القلب الميوسين (MYH6)8،،من1213وكونيكسين 43 (Cx43)14،،من1516. تم أساليب استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا) والخلايا الجذعية pluripotent (PSCs) دقة الأمثل ومناقشتها بشأن تفاصيل العوامل الاستقرائية والأكسجين والمغذيات التدرجات، والتوقيت الدقيق للعمل5،،من67،،من1718. ومع ذلك، تقديم التكنولوجيات القائمة على ESC ومجلس السلام والأمن لا تزال الشواغل الأخلاقية وسلامة متعددة، جنبا إلى جنب مع ميزات الكهربية والمناعية الأمثل19،20. يستضيف زرع هذه الخلايا غالباً ما تجربة إيمونوريجيكتيون وتتطلب الكبت المناعي الدائمة. وهذا يرجع أساسا إلى غير متطابقة histocompatibility الرئيسية المعقدة جزيئات (MHC) في البلدان المضيفة والمانحة، وإلى استجابة تي خلية الناتج21. بينما MHC الفردية الفئة الأولى مطابقة حل ممكن، تتطلب ممارسة سريرية أكثر يسرا مصدر خلية عالمياً إيمونوبريفيليجيد للتغلب على قلق الرفض.

كمصدر لخلايا بديلة للاستخدام في التطبيقات السريرية، MSCs وخاصة، بمسكس، قد حقق لاستخدامها في تجديد الأنسجة منذ الوصف الأولى في عام 199522. ويعتقد أن الخلايا التجدد المقيمين التي يمكن العثور عليها في ما يقرب من أي أنسجة vascularized23MSCs. عند عزلة من المصدر المطلوب، MSCs يمكن توسيعها بسهولة في الثقافة، ولديها القدرة paracrine واسعة النطاق، وكثيراً ما تملك إيمونوبريفيليجيد أو إيمونومودولاتوري خصائص24،25. سلامتهم ونجاعة الفعل ثبت في العديد من الدراسات ما قبل السريرية، لا سيما لإنعاش القلب3،26.

استخدام العديد من استراتيجيات التمايز MSC وكلاء الدوائية، مثل 5-أزاسيتيديني22 و [دمس]27، والنمو أو morphogenic عوامل، مثل BMPs5،7،،من2829 أو انجيوتنسين الثاني30، مع كفاءة متغير. هذه الاستراتيجيات، ومع ذلك، لا تقوم على العقبات التي خلية التجدد ساذجة من المرجح أن تواجه بعد صاروخ موجه أو يجري تسليمها إلى موقع الإصابة المجراة في. الاستراتيجيات ذات الصلة أكثر من الناحية الفسيولوجية، بينما من الصعب تحديد والتلاعب، تستند إلى الافتراض بأن التمايز ماجستير يمكن أن يتسبب من خلال إشارات من المكروية الأنسجة نفسها. الدراسات السابقة قد أظهرت أن التعرض لخلايا القلب ليساتيس31 أو32،عضلة القلب البطين33، أو توجيه الاتصال مع كارديوميوسيتيس الأولية في المختبر15،34، يمكن زيادة التعبير عن علامات القلب في MSCs. الآخرين أثبتت كارديوميوجينيسيس عفوية بعد علاج إصابات القلب مع MSCs35،36،،من3738، على الرغم من أن في جزء منه، تولد الانصهار من بمسكس وكارديوميوسيتيس،من3940 عضلة القلب الوليدة. على حد علمنا، كارديوميوسيتيس الوظيفية، المتعاقدة عفويا من MSCs البشرية (همسكس) من أي مصدر الأنسجة لم تم تبلغ بعد.

توافق الآراء الحالي أن MSCs كافة تنشأ من ارتشاح الخلايا23. يمكن أن يكون الشباب MSCs مع خصائص بيريسيتي المعزولة من منطقة ارتشاح في الحبل السري البشري الأنسجة41،،من4243. بالمقارنة مع بمسكس، تمتلك هوكبفكس احتمال ازدياد التمايز والعديد من المزايا الأخرى التجدد، على حد سواء في المختبر41،44 و في فيفو45،،من4647. جدير بالذكر أن المصدر يجري على واجهة الأم الجنين، قد هوكبفكس الاستمناع أقل بكثير مقارنة بمصادر الكبار من MSCs. ابحاثنا ويركز على توصيف وتطبيقات ما قبل السريرية من FTM هوكبفكس، مصدر أصغر من التحقيق، MSCs التي أثبتنا سابقا بزيادة مولتيلينيجي التكاثري وأعلى تمايز القدرات، بما في ذلك في النسب كارديوميوجينيك41.

نقدم هنا، بروتوكول يجمع بين تشكيل التجميعية وخلية القلب الابتدائي تغذية الطبقات كما تقدم قوات الاستقرائي لتحقيق التمايز كارديوميوجينيك كاملة من MSCs. المجاميع بيئة ثلاثية الأبعاد، ونماذج أفضل الشروط في فيفو مقارنة بالثقافات ملتصقة 2D. استخدام طبقات تغذية القلب يوفر بيئة ممثل الموقع زرع الأعضاء في نهاية المطاف MSCs. نظهر أن مصادر الأصغر سنا من MSCs المعزولة من حبل السرة قبل أو بعد الولادة لها قدرة أعلى لمجاميع النموذج والوصول إلى النمط الظاهري القلب بالمقارنة مع بمسكس الكبار، مع الحفاظ على جهاز المناعة-الامتياز. إلى جانب ارتفاع حاد النسب القلب علامة الجينات والتعبير المتعمد من داخل الخلايا (أي، كتنت و MYH6) والبروتينات على سطح الخلية (أي، سيربا و Cx43) محددة ل cardiomyocytes، نحن تظهر أنه يمكن تسخير إمكانيات التمايز هوكبفكس FTM مع هذا الأسلوب، وأنها يمكن أن تؤدي إلى المقاولات كارديوميوسيتي-مثل الخلايا تلقائياً.

Protocol

All studies involving animals were conducted and reported according to ARRIVE guidelines48. All studies were performed with institutional research ethics board approval (REB number 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, University of Toronto, Toronto, Canada). All animal procedures were approved by the Animal Care Committee of the University Health Network (Toronto, Canada), and all animals received humane care in compliance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8…

Representative Results

HUCPVCs Display Higher Aggregate-formation Potential and CD49f Expression Levels Compared to BMSCs: To induce the differentiation of hMSCs (i.e., FTM HUCPVCs, term HUCPVCs, and BMSCs), single-cell suspensions of undifferentiated MSCs or MSC-containing hanging drops (Table 1) were transferred onto rat primary cardiomyocyte monolayers to establish direct co-cultures or aggregate co-cultur…

Discussion

تم التفريق بين القلب من الخلايا الجذعية تحت التطوير لأكثر من 2 عقود، مع العديد من الاستراتيجيات المختلفة المستخدمة لتوليد الخلايا مثل كارديوميوسيتي من مصادر لجنة السلامة البحرية. العديد من هذه الاستراتيجيات، ومع ذلك، غير فعالة، وغالباً ما لا شروط استخدام ممثل بيئة زرع الخلايا اللقاء ف…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب أشكر الموظفين التالية وبحوث الأفراد لمساهماتها: ماثيو ليبراتش، ماغين ليلى، تانيا ألف Baretto، وشلوميت كينيغزبيزغ، وأندريه غوتييه-فيشر. هذا العمل كان يدعمها “الصندوق البحوث أونتاريو”-التميز البحثي (ORF-RE، جولة #7) وإنشاء شركة البرنامج

Materials

0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation
Alpha-MEM Gibco 12571071 For HUCPVC and BMSC culture media.
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody Biolegend 313612 Integrin marker for FC
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody R&D Systems FAB7737A Connexin 43 marker for FC
FITC-conjugated HLA-A2 antibody Genway Biotech Inc. GWB-66FBD2 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody Abcam ab7904 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody AbD Serotec/Bio-Rad MCA2518F Cardiac marker for FC
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195A Human cell marker for FC and FACS
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195F Human cell marker for FC and FACS
Anti-connexin 43/GJA1 antibody Abcam ab11370 Cx43. For ICC
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21428 For ICC
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody Abcam ab9465 aSARC. For ICC
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21426 For ICC
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody New England BioLabs Ltd. 5030S For ICC
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies A-21206 For ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody EMD Millipore MAB1281 For ICC
MZ9.5 Stereomicroscope Leica For imaging aggregates.
1.5 ml centrifuge microtubes Axygen MCT-150-C For staining MSCs with fluorescent dye.
ImageJ Open source image processing software.
Aria II  BD UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Bone marrow mesechymal stromal cells Lonza PT-2501 BMSCs
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-100G BSA. To prepare solutions for ICC
BrdU EMD Millipore MAB3424 Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.
Canto II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
cDNA EcoDry Premix Clontech/Takara 639570 For preparation of cDNA for qPCR
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies C7025 Fluorescent imaging of cell cytoplasm
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 For cell counting
DMEM-F12 Sigma-Aldrich D6421 For rat primary cardiomyocyte culture medium.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 10010023 D-PBS, without Ca2+, Mg2+
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope
FACSCalibur BD In-house. For flow cytometry.
Fetal bovine serum (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 FBS. Component of cell culture medium.
IDT Prime Time qPCR probes Integrated Data Technologies FAM fluorophore http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium ThermoScientific TA-030-FM For storage of cells to undergo ICC
LSR II  BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Normal goat serum Cell Signaling Technology 5425S NGS. Used in blocking solution for ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells Thermo Scientific Nunc 155409 To prepare samples for ICC
OmniPur Triton X-100 Surfactant EMD Millipore 9410-OP As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710 For fixing cells for ICC.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Component of cell culture medium.
Primers Sigma Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk Confocal Zeiss SickKids Imaging Facility
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes ReproCell RCD001N Positive control for qPCR
RNeasy mini kit Qiagen 74106 To isolate RNA for qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074 For qPCR with master mix
RPMI 1640 Gibco A1049101 For MSC, monocyte coculture medium.
TaqMan qPCR primer assays Thermo Fisher Scientific 4444556 For qPCR
Trypan Blue Life Technologies T10282 Staining of cells for viability and counting
Trypsin Gibco 272500108 For cell dissociation
Volocity Perkin-Elmer Volocity 6.3 Imaging software
0.2 μm pore filter Thermo Fisher Scientific 566-0020 For sterilizing tissue culture media
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat heart. Can use any similar forceps.
Scissors Fine Science Tools 14059-11 For mincing rat heart. Curved scissors recommended.
50 mL tube BD Falcon 352070 For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
6-well plates Thermo Scientific Nunc CA73520-906 For tissue culture
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For aggregate formation
Axiovert 40C Microscope Zeiss For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting
Triton X-100 EMD Millipore 9410-1L Used in permeabilization solution for ICC
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain used during visualization of Cx43 localization
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation “in vitro” of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Tags

Mesenchymal Stem CellsCardiomyocyte DifferentiationIn Vitro DifferentiationCardiac Fetal LayersCardiovascular DiseaseTrypsin DigestionDMEM-F12MSC CulturesCell Dissociation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal, F., Librach, C. L. In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells. J. Vis. Exp. (126), e55757, doi:10.3791/55757 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image