In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Insufficienza cardiaca congestizia (CHF) persiste come delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Il CHF accade spesso seguendo la perdita massiccia di cardiomiociti e lo sviluppo del tessuto di cicatrice senza cellula come risultato patologico di un infarto miocardico (MI)¹. Mentre il cuore è un organo parzialmente autorinnovabile, piscina di cella residente, staminali e progenitrici, responsabile per l’esecuzione di rigenerazione tissutale significativamente diminuisce in abbondanza e la funzione in pazienti invecchiati, diventando spesso insufficiente per un recupero ottimale dopo la ferita. Così, c’è grande interesse nello sviluppo di trattamenti sperimentali che coinvolgono il trapianto delle cellule del donatore sano nel miocardio danneggiato. È imperativo che le cellule del donatore non solo ripristino la struttura del tessuto, ma anche realizzare il recupero funzionale del miocardio interessato.

Cuore natale impiega cuore tessuto residenti e cellule staminali endogene del midollo osseo-originario di alberino-ferita riparazione^2,3,4. Donatore-derivati rigenerativa e di cellule-host allo stesso modo, deve avere la capacità di ottenere il fenotipo appropriato e funzione nel microambiente del miocardio che ritocco, insieme alla capacità di efficienza e sicurezza sostituire le cellule perse. Metodi di differenziazione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per realizzare dei cardiomiociti ad alta efficienza, basati su cellule staminali produzione^5,6. Il profilo di espressione di marcatori di linea cardiaca viene utilizzato per definire il processo di differenziazione delle cellule staminali verso la linea cardiaca⁷. Marcatori di precoce differenziazione, quali NKX 2.5, fattore di rinforzatore del miocita 2C (Mef2c) e GATA4^8,9, può essere un’indicazione dell’inizio del processo di cardiomiogenici. Marcatori del cardiomyocyte maturo comunemente usati per valutare l’efficacia di differenziazione sono segnale proteina regolatrice α (SIRPA)¹⁰, troponina cardiaca T (cTnT)¹¹, catena pesante della miosina cardiaca (MYH6)^8,12,13e connessina 43 (Cx43)^14,15,16. I metodi di utilizzo di cellule staminali embrionali (ESCs) e cellule staminali pluripotenti (PSC) sono stati accuratamente ottimizzati e discussi per quanto riguarda i dettagli di fattori induttivi, ossigeno e nutrienti gradienti e l’esatta tempistica di azione^5,6,7,17,18. Ciò nonostante, tecnologie basate su ESC e PSC presentano ancora più preoccupazioni etiche e sicurezza, insieme non ottimali caratteristiche elettrofisiologiche ed immunologiche^19,20. Padroni di casa trapiantati con queste cellule spesso esperienza immunorejection e richiedono l’immunosoppressione permanente. Ciò è dovuto principalmente molecole di istocompatibilità (MHC) complesse nell’ospite ed il donatore e il risultante della T-cellula risposta²¹di disadattamento. Mentre singoli MHC di classe I di corrispondenza è una possibile soluzione, una pratica clinica più accessibile richiederebbe una fonte di cellule che universalmente è nuova per superare la preoccupazione del rifiuto.

Come fonte alternativa cellulare per l’uso in applicazioni cliniche, MSCs e in particolare, BMSC, sono stati studiati per l’uso nella rigenerazione del tessuto dalla loro descrizione iniziale nel 1995²². MSCs sono creduti per essere cellule rigenerative residenti che possono essere trovate in quasi qualsiasi tessuto vascolarizzato²³. Isolamento dalla sorgente desiderata, MSCs possono essere facilmente espanse in coltura, hanno capacità estesa paracrine e possiedono spesso nuova o immunomodulatori proprietà^24,25. Loro sicurezza ed efficacia hanno già dimostrati in parecchi studi pre-clinici, in particolare per la rigenerazione cardiaca^3,26.

Molte strategie di differenziazione di MSC utilizzano agenti farmacologici, quali 5-azacytidine²² e DMSO²⁷e crescita o fattori morfogenetici, come BMPs^5,7,28,29 o dell’angiotensina-II³⁰, con efficienza variabile. Queste strategie, tuttavia, non sono basate sugli ostacoli che una cella rigenerativa ingenuo è probabile incontrare dopo homing o recapitati al sito della lesione in vivo. Strategie più fisiologicamente rilevanti, mentre più difficile da definire e manipolare, si basano sulla premessa che MSC differenziazione può essere indotta attraverso segnali dal microambiente del tessuto stesso. Gli studi precedenti hanno dimostrato che l’esposizione alla cellula cardiaca lisati³¹ o miocardio ventricolare^32,33, o diretto contatto con primaria cardiomiociti in vitro^15,34, può aumentare l’espressione di marcatori cardiaci in MSCs. Gli altri hanno dimostrato cardiomiogenesi spontanea dopo trattamento di lesioni cardiache con MSCs^35,36,37,38, anche se in parte, la fusione di BMSC e cardiomiociti^39,40 generato il miocardio nascente. A nostra conoscenza, non sono ancora stati segnalati cardiomiociti funzionali, spontaneamente contraenti da MSCs umane (hMSCs) di qualsiasi origine di tessuto.

Il consenso corrente è che tutti i MSCs derivano da perivascolari cellule²³. MSCs giovane con proprietà Pericita può essere isolato dalla regione perivascolare del cordone ombelicale umano tessuto^41,42,43. Rispetto alle BMSCs, HUCPVCs possiedono una maggiore differenziazione potenziale e diversi altri vantaggi rigenerative, entrambi in vitro^41,44 ed in vivo^45,46,47. In particolare, la fonte che è l’interfaccia materno-fetale, HUCPVCs le immunogenicità significativamente più basso rispetto alle fonti di adulti di MSCs. La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione e applicazioni pre-cliniche di FTM HUCPVCs, la fonte più giovane di MSCs studiato, che precedentemente abbiamo indicato sono aumentati multilineage proliferative e superiore capacità di differenziazione, tra cui nel lignaggio cardiomiogenici⁴¹.

Qui, presentiamo un protocollo che unisce formazione aggregata e strati dell’alimentatore primario delle cellule cardiache come forze induttive per raggiungere la differenziazione di cardiomiogenici completa di MSCs. aggregati forniscono un ambiente 3D, che modelle migliori condizioni in vivo rispetto al 2D culture aderente. Utilizzando livelli cardiaci alimentatore fornisce un ambiente che è rappresentante del sito ultimate trapianto per MSCs. Dimostriamo che più giovane fonti di cellule staminali mesenchimali isolate da cordone ombelicale pre- o post-natali hanno una maggiore capacità di formare aggregati e raggiungere il fenotipo cardiaco rispetto al BMSCs adulto, mantenendo comunque il loro privilegio immunitario. Oltre la ripida elevazione dei geni marcatori di linea cardiaca e l’espressione indotta di intracellulare (cioè, cTnT e MYH6) e proteine di superficie cellulare (vale a dire, SIRPA e Cx43) specifico per cardiomiociti, indichiamo che il potenziale di differenziazione di FTM HUCPVCs possa essere imbrigliato con questo metodo e che possono dare origine a spontaneamente contraenti del cardiomyocyte-come le cellule.