In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Congestief hartfalen (CHF) blijft bestaan als een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. CHF treedt vaak op na het massale verlies van cardiomyocytes en de ontwikkeling van cel-vrije littekenweefsel als gevolg van een myocardinfarct (MI)¹pathologische. Terwijl het hart een gedeeltelijk zichzelf vernieuwende orgaan is, vermindert de resident stam en progenitor cel pool verantwoordelijk voor de uitvoering van weefselregeneratie aanzienlijk in overvloed en functie in leeftijd patiënten, vaak steeds onvoldoende voor optimaal herstel na blessure. Er is dus grote belangstelling bij de ontwikkeling van experimentele behandelingen waarbij de transplantatie van cellen van de gezonde donor in het beschadigde myocardium. Het is noodzakelijk dat de donor cellen niet alleen de structuur van het weefsel herstellen, maar ook het bereiken van het functionele herstel van de getroffen myocard.

De inheemse hart hart weefsel-ingezetene werkzaam en endogene afkomstig is van het beenmerg cellen van de stam voor na letsel herstellen^2,3,4. Regeneratieve cellen-host – en donor-afgeleide gelijk moet hebben de capaciteit om het verkrijgen van de juiste fenotype en functie in de communicatie van de remodelleert myocard, samen met het vermogen om efficiënt en veilig de verloren cellen vervangen. In vitro differentiatie methoden hebben is gebruikt uitgebreid tot hoogrenderende, stamcel gebaseerde cardiomyocyte productie^5,6. Het profiel van de expressie van cardiale lineage markers wordt gebruikt voor het definiëren van het proces van differentiatie van de stamcel naar de cardiale lineage⁷. Vroege differentiatie markers, zoals NKX2.5, myocyte versterker factor 2 C (Mef2c), en GATA4^8,9, kunnen een indicatie van de opening van het cardiomyogenic-proces. Volwassen cardiomyocyte markeringen gebruikte om differentiatie effectiviteit te beoordelen zijn signaal regelgevende proteïne α (SIRPA)¹⁰, cardiale troponine T (cTnT)¹¹, zware ketting cardiale myosin (MYH6),^8,,^12,13en connexin 43 (Cx43)^14,15,16. De methoden gebruiken van embryonale stamcellen (SER’s) en pluripotente stamcellen (PSC’s) zijn grondig geoptimaliseerd en besproken met betrekking tot de details van de inductieve factoren, zuurstof en voedingsstoffen verlopen, en de exacte timing van actie^5,6,7,17,18. ESC – en PVC-gebaseerde technologieën presenteren echter nog steeds meerdere ethische en veiligheid zorgen, samen met suboptimaal elektrofysiologische en immunologische functies^19,20. Hosts getransplanteerde met deze cellen vaak ervaren immunorejection en permanente immuunsuppressie vereisen. Dit is voornamelijk te wijten aan de grote histocompatibility complex (MHC) moleculen in de gastheer en de donor en de resulterende T-cel reactie²¹mismatching. Terwijl individuele MHC klasse I matching is een mogelijke oplossing, een toegankelijker klinische praktijk zou vereisen een cel bron die universeel immunoprivileged te overwinnen van de bezorgdheid van de afwijzing.

Als een bron van alternatieve cel voor gebruik in klinische toepassingen, MSCs en in het bijzonder, BMSCs, zijn onderzocht voor gebruik in weefselregeneratie sinds hun initiële beschrijving in 1995²². MSCs worden verondersteld om ingezetene regeneratieve cellen die worden in bijna elke gevacuoliseerd weefsel^{23 gevonden kunnen}. Bij isolatie van de gewenste bron, MSCs kunnen gemakkelijk worden uitgebreid in cultuur, hebben uitgebreide paracrine capaciteit, en vaak immunoprivileged of immunomodulerende eigenschappen^24,25te bezitten. Hun veiligheid en de werkzaamheid hebben reeds te zien in verscheidene pre-klinische studies, met name voor cardiale regeneratie^3,26.

Veel MSC differentiatie strategieën gebruik maken van farmacologische stoffen, zoals 5-azacytidine²² en DMSO²⁷, en groei of morfogenisch factoren, zoals BMP’s^5,7,28,29 of angiotensine-II³⁰, met variabele efficiëntie. Deze strategieën, zijn echter niet gebaseerd op de obstakels die een naïeve regeneratieve cel is waarschijnlijk tegenkomen na homing of wordt geleverd aan de site van letsel in vivo. Meer fysiologisch relevante strategieën, terwijl moeilijker te definiëren en manipuleren, zijn gebaseerd op de vooronderstelling dat MSC differentiatie kan worden opgewekt door middel van signalen uit het weefsel communicatie zelf. Eerdere studies hebben aangetoond dat de blootstelling aan de cardiale cel lysates³¹ of ventriculaire myocard^32,33, of rechtstreeks contact met primaire cardiomyocytes in vitro^15,34, kan de expressie van cardiale markers in MSCs verhogen. Anderen hebben aangetoond dat spontane cardiomyogenesis na behandeling van cardiale letsel met MSCs^35,36,^,37,38, hoewel gedeeltelijk, de fusie van BMSCs en cardiomyocytes^39,40 het ontluikende myocardium gegenereerd. Om onze kennis, hebben functionele, spontaan aanbestedende cardiomyocytes van menselijke MSCs (hMSCs) van elke bron weefsel nog niet is gerapporteerd.

De huidige consensus is dat alle MSCs uit gerelateerde cellen^{23 voortvloeien}. Young MSCs met pericyte eigenschappen kunnen worden geïsoleerd uit de regio gerelateerde van menselijke navelstreng weefsel^41,42,43. In vergelijking met BMSCs bezitten HUCPVCs meer differentiatie potentiële en verschillende andere regeneratieve voordelen, zowel in vitro^41,44 en in vivo^45,46,47. Met name hebben de bron wordt de moeders-foetale interface, HUCPVCs aanzienlijk lager immunogeniciteit in vergelijking met volwassen bronnen van MSCs. Ons onderzoek richt zich op de karakterisering en de pre-klinische toepassingen van FTM HUCPVCs, de jongste bron van MSCs onderzocht, die wij hebben eerder getoond te zijn toegenomen proliferatieve en hogere multilineage differentiatie capaciteiten, met inbegrip van de cardiomyogenic afstamming⁴¹.

Hier presenteren we een protocol die totale vorming en primaire cardiale cel feeder lagen combineert zoals inductieve krachten te bereiken van de differentiatie van de volledige cardiomyogenic van MSCs. aggregaten leveren een 3D-omgeving, die beter voorwaarden in vivo in vergelijking met 2D aanhangend culturen modellen. Met behulp van cardiale feeder lagen biedt een omgeving die representatief is voor de site van de ultieme transplantatie voor de MSCs. We laten zien dat jongere bronnen van MSCs geïsoleerd van pre- of postnatale umbilical koorden een hogere capaciteit formulier aggregaten en hebben te bereiken van de cardiale fenotype in vergelijking met volwassen BMSCs, terwijl nog het handhaven van hun immuun-voorrecht. Naast de steile verhoging van markers van cardiale bloedlijn en de geïnduceerde expressie van intracellulaire (dat wil zeggen, cTnT en MYH6) en celoppervlak eiwitten (dat wil zeggen, SIRPA en Cx43) specifiek voor cardiomyocytes, we laten zien dat het potentieel van de differentiatie van FTM HUCPVCs met deze methode kan worden aangewend en dat zij aanleiding geven kunnen tot spontaan verdragsluitende cardiomyocyte-achtige cellen.