In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

Insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) persiste como una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. CHF ocurre a menudo después de la masiva pérdida de cardiomiocitos y el desarrollo de tejido cicatricial sin células como el resultado patológico de un infarto de miocardio (IM)¹. Mientras que el corazón es un órgano parcialmente renovado, la residente madre y progenitoras celulares piscina responsable de ejecutar la regeneración tisular significativamente disminuye en abundancia y la función en pacientes envejecidos, a menudo convertirse en insuficiente para la recuperación óptima después de la lesión. Así, hay gran interés en el desarrollo de tratamientos experimentales que implican el trasplante de células de un donante sano en el miocardio dañado. Es imprescindible que las células del donante no sólo restauración la estructura del tejido, sino que también logran la recuperación funcional del miocardio afectado.

El corazón nativo emplea tejido reside en el corazón y endógenas originados en la médula ósea las células madre para después de la lesión de reparación^2,3,4. Regenerativa células huésped derivadas y del donante-por igual-deben tener la capacidad de obtener el fenotipo apropiado y la función en el microambiente del miocardio remodelado, junto con la capacidad de manera eficiente y segura reemplazar las células perdidas. Métodos de diferenciación in vitro se han utilizado ampliamente para lograr la producción de cardiomiocitos de alta eficiencia, basada en la célula de vástago^5,6. El perfil de expresión de marcadores de linaje cardíaco se utiliza para definir el proceso de diferenciación de células madre hacia el linaje cardíaco⁷. Diferenciación marcadores tempranos, tales como NKX2.5, factor potenciador de miocito 2C (Mef2c) y GATA4^8,9, pueden ser un indicio de la iniciación del proceso cardiomiogenético. Cardiomiocitos maduros marcadores utilizados para evaluar la eficacia de diferenciación son señal de regulador de la proteína α (SIRPA)¹⁰, troponina cardíaca T (cTnT)¹¹, cadena pesada de miosina cardiaca (MYH6)^8,12,13y conexina 43 (Cx43)^14,15,16. Los métodos utilizando células madre embrionarias (ESCs) y células madre pluripotentes (PSC) han sido completamente optimizados y discutido sobre los detalles de factores inductivos de gradientes de nutrientes y oxígeno y la sincronización exacta de acción^5,6,7,17,18. Sin embargo, tecnologías basadas en el ESC y el PSC aún presentan múltiples problemas éticos y de seguridad, junto con características electrofisiológicas e inmunológicos subóptima^19,20. Transplantados con estas células a menudo experiencia immunorejection y requiere inmunosupresión permanente. Esto se debe principalmente a unir mal histocompatibilidad complejo () las moléculas de MHC en el host y de los donantes y a la resultante t-célula respuesta²¹. Mientras que los MHC de clase I que empareja es una posible solución, una práctica clínica más accesible requeriría una fuente de células que es universal immunoprivileged para superar la preocupación de rechazo.

Como una fuente alternativa de la célula para su uso en aplicaciones clínicas, MSCs y, en particular, BMSCs, han sido investigados para su uso en la regeneración de los tejidos desde su descripción inicial en 1995²². MSCs se creen para ser residente células regenerativas que pueden encontrarse en casi cualquier tejido vascularizado²³. A aislamiento de la fuente deseada, MSCs pueden ampliarse fácilmente en la cultura tienen capacidad amplia paracrina y poseen a menudo immunoprivileged o inmunomoduladores propiedades^24,25. Su seguridad y eficacia han ya demostrados en varios estudios preclínicos, en particular para la regeneración cardiaca^3,26.

Muchas estrategias de diferenciación de MSC utilizan a agentes farmacológicos, tales como 5-azacitidina²² y²⁷de DMSO y crecimiento o factores morfogénicos, como ordenación^5,7,28,29 o angiotensina II³⁰, con eficacia variable. Sin embargo, estas estrategias no están basadas en los obstáculos que un ingenuo regenerador celular es probable encontrar después de autoguiado hacia el blanco o ser entregado al sitio de lesión en vivo. Estrategias más fisiológicamente relevantes, mientras que la más difícil de definir y manipular, se basan en la premisa que la diferenciación MSC puede ser inducida a través de señales del microambiente del tejido propio. Estudios previos han demostrado que la exposición a los lysates de la célula cardiaca³¹ o el miocardio ventricular^32,33o dirigen contacto con cardiomiocitos primarios en vitro^15,34, puede aumentar la expresión de marcadores cardiacos en MSCs. Otros han demostrado cardiomyogenesis espontánea después de tratar heridas cardiacas con MSCs^35,36,37,38, aunque en parte, la fusión de BMSCs y cardiomiocitos^39,40 generados por el miocardio naciente. A nuestro conocimiento, todavía no se han divulgado cardiomiocitos funcionales, espontáneamente contratación de MSCs humanos (hMSCs) de cualquier fuente de tejido.

El consenso actual es que todos MSCs surgen de células perivasculares²³. Jóvenes de MSCs con propiedades pericyte puede ser aislado de la región perivascular del tejido de cordón umbilical humano^41,42,43. En comparación con BMSCs, HUCPVCs poseen potencial mayor diferenciación y varias otras ventajas regenerativas, tanto en vitro^41,44 y en vivo^45,46,47. En particular, la fuente ser la interfaz materno-fetal, HUCPVCs tienen menor inmunogenicidad en comparación con adultos fuentes de MSCs. Nuestra investigación se centra en la caracterización y aplicaciones preclínicas de FTM HUCPVCs, la fuente más joven de MSCs investigado, que previamente hemos demostrado aumentaron multilineage proliferativa y mayor capacidad de diferenciación, incluyendo en el linaje de cardiomiogenético⁴¹.

Aquí, presentamos un protocolo que combina capas de alimentador primario de la célula cardiaca y formación agregada como fuerzas inductivas para lograr la diferenciación de cardiomiogenético completa de MSCs. agregados proporcionan un entorno 3D que modela mejor condiciones en vivo frente a culturas adherentes 2D. Utilizando capas cardiacas alimentador proporciona un entorno que es representativa del sitio de trasplante definitivo de las MSCs. Nos demuestran que jóvenes fuentes de MSCs aisladas de cordón umbilical antes o después del parto tienen una mayor capacidad para formar agregados y alcanzar el fenotipo cardíaco en comparación con adultos BMSCs, mientras que todavía mantiene su privilegio inmune. Además de la elevación escarpada de genes marcadores de linaje cardíaco y la expresión inducida de intracelular (es decir, reposo y MYH6) y proteínas de la superficie de la célula (es decir, SIRPA y Cx43) específico para cardiomiocitos, demostramos que se puede aprovechar el potencial de diferenciación de la FTM HUCPVCs con este método y que puede dar lugar a contraer espontáneamente cardiomiocitos-como las células.