In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Herzinsuffizienz (CHF) bleibt als eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. CHF tritt häufig nach den massiven Verlust von Kardiomyozyten und die Entwicklung der zellfreien Narbengewebe als pathologische Ergebnis ein Myokardinfarkt (MI)¹. Während das Herz ein teilweise selbst erneuernde Organ ist, verringert sich residente Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Pool verantwortlich für die Regeneration des Gewebes deutlich Ausführung in Hülle und Fülle und Funktion bei gealterten Patienten oft nicht ausreichend für optimale Erholung nach einer Verletzung zu. So gibt es großes Interesse an der Entwicklung von experimentellen Behandlungen, bei denen die Transplantation von gesunden Spenderzellen in den Geschädigten Myokard. Es ist zwingend notwendig, dass die Spenderzellen nicht nur die Struktur des Gewebes wiederherzustellen, sondern auch die funktionelle Wiederherstellung der betroffenen Myokard.

Die native Herz beschäftigt Herz Gewebe-Resident und endogenen Knochenmark stammen Stammzellen zur posttraumatischen reparieren^2,3,4. Regenerative Zellen-Host und Spender abgeleitet gleichermaßen muss haben die Fähigkeit, die entsprechenden Phänotyp und Funktion in der Mikroumgebung umgestaltet Myokard, sowie die Fähigkeit, effizient und sicher die verlorenen Zellen ersetzen zu erhalten. In Vitro Differenzierung Methoden sind weitgehend benutzt, um eine hocheffiziente, stammzellbasierte Cardiomyocyte Produktion^5,6zu erreichen. Expressionsprofil kardiale Linie Marker wird verwendet, um den Prozess der Stammzell-Differenzierung in der kardialen Linie⁷Richtung zu definieren. Frühe Differenzierung Marker wie NKX2.5, Myozyten Enhancer Faktor 2 C (Mef2c) und GATA4^8,9, kann einen Hinweis über die Einleitung des Cardiomyogenic Prozesses. Reife Cardiomyocyte Marker häufig verwendet, um Differenzierung Wirksamkeit zu beurteilen sind Signal regulatorischen Protein α (SIRPA)¹⁰, kardiale Troponin T (cTnT)¹¹, schwere Kette kardialen Myosin (MYH6)^8,12,13und Connexin 43 (Cx43)^14,15,16. Die Methoden, die Verwendung von embryonalen Stammzellen (WSR) und pluripotenten Stammzellen (EAP) wurden sorgfältig optimiert und diskutiert über die Details der induktive Faktoren, Sauerstoff und Nährstoff Steigungen und der genaue Zeitpunkt der Aktion^5,6,7,17,18. Dennoch präsentieren ESC und PSC-basierten Technologien noch mehrere Sicherheit und ethische Bedenken zusammen mit suboptimalen elektrophysiologische und immunologischen Funktionen^19,20. Gastgeber, die oft mit diesen Zellen transplantiert erleben Immunorejection und erfordern ständige Immunsuppression. Dies ist vor allem auf großen Histocompatibility Komplexes (MHC) Moleküle in dem Host und dem Spender und der daraus resultierenden T-Zell Antwort²¹Fehlanpassungen. Während einzelne MHC Klasse I matching ist eine mögliche Lösung, eine zugänglichere klinische Praxis würde benötigen eine Zelle, die allgemein die Immunabwehr, die Sorge der Ablehnung zu überwinden ist.

Als alternative Zelle Quelle für den Einsatz in der klinischen Anwendung, MSCs und insbesondere BMSCs, wurden für den Einsatz in Geweberegeneration seit ihrer Erstbeschreibung im Jahr 1995²²untersucht. MSCs werden geglaubt, um Wohnsitz regenerativen Zellen, die in nahezu jedem vaskularisierte Gewebe²³gesucht werden kann. Bei der Isolierung von der gewünschten Quelle MSCs können leicht erweitert werden, in der Kultur, haben umfangreiche parakrine Kapazität und oft besitzen Immunabwehr oder immunmodulatorische Eigenschaften^24,25. Ihre Sicherheit und Wirksamkeit wurden bereits in mehreren präklinischen Studien, insbesondere zur kardialen Regeneration^3,26gezeigt.

Viele MSC Differenzierungsstrategien nutzen pharmakologische Wirkstoffe, wie z. B. 5-Azacytidine²² und DMSO²⁷, und Wachstum oder morphogenetische Faktoren wie BMPs^5,7,28,29 oder Angiotensin-II³⁰, mit Variablen Wirkungsgrad. Diese Strategien basieren jedoch nicht auf die Hindernisse, die eine naiven regenerative Zelle nach Homing oder an der Stelle der Verletzung auftreten dürfte in-vivo. Mehr physiologisch relevante Strategien zwar schwieriger zu definieren und zu manipulieren, basieren auf der Prämisse, dass MSC Differenzierung durch Signale aus dem Gewebe Mikroumgebung selbst induziert werden kann. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber der Herzmuskelzellen Lysates³¹ oder Linksventrikuläres Myokard^32,33, oder direkt Kontakt mit primären Kardiomyozyten in-vitro-^15,34, den Ausdruck der kardialen Marker im MSCs erhöhen kann. Andere zeigten spontane Cardiomyogenesis nach Behandlung von kardialen Verletzungen mit MSCs^35,36,37,38, zwar einerseits die Verschmelzung von BMSCs und Herzzellen^39,40 der im Entstehen begriffenen Myokard generiert. Nach unserem Kenntnisstand haben funktionelle, spontan Auftraggeber Herzzellen von menschlichen MSCs (hMSCs) von einer beliebigen Quelle Gewebe noch nicht gemeldet.

Der aktuelle Konsens ist, dass alle MSCs aus perivaskuläre Zellen²³entstehen. Young-MSCs mit Pericyte Eigenschaften können aus der perivaskuläre Region der menschlichen Nabelschnur Gewebe^41,42,43isoliert werden. Im Vergleich zu BMSCs besitzen HUCPVCs erhöhte Differenzierungspotenzial und einige andere regenerative Vorteile, sowohl in-vitro-^41,44 und in Vivo^45,46,47. Insbesondere habe die Quelle als mütterlich fötalen Schnittstelle, HUCPVCs deutlich geringer im Vergleich zu Erwachsenen Quellen von MSCs Immunogenität. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung und prä-klinischen Anwendungen von FTM HUCPVCs, die jüngste Quelle der MSCs untersucht, die wir zuvor gezeigt haben, proliferative und höhere Multilineage gestiegen Differenzierung Kapazitäten, namentlich auf der Cardiomyogenic Linie⁴¹.

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Aggregatbildung und primäre kardiale Zellschichten Feeder verbindet wie induktive Kräfte, die komplette Cardiomyogenic Differenzierung von MSCs. Aggregate zu erreichen eine 3D Umgebung bieten die besseren Bedingungen in Vivo im Vergleich zu 2D anhaftende Kulturen Modelle. Verwendung von kardialen Feeder Schichten bietet eine Umgebung, die repräsentativ für die ultimative Transplantation-Website für die MSCs ist. Wir zeigen, dass jüngere Quellen von MSCs isoliert vor oder nach der Geburt die Nabelschnur eine höhere Kapazität, Form Aggregate und den kardialen Phänotyp im Vergleich zu Erwachsenen BMSCs haben, unter Beibehaltung ihrer immun-Privileg zu erreichen. Neben der steilen Höhe des kardialen Linie Marker-Gene und die induzierte Expression von intrazellulären (d. h. cTnT und MYH6) und Zelle-Oberfläche Proteine (z.B. SIRPA und Cx43) speziell für Kardiomyozyten, wir zeigen, dass die Differenzierung Potenzial von FTM HUCPVCs kann, mit dieser Methode genutzt werden und sie spontan Infizierung Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen hervorrufen können.