学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

1. 試薬 6.7 g 酵母窒素ベース 20 g ブドウ糖やガラクトース、20 mg アデニン硫酸塩 (200 mg/100 mL の水溶液原液 10 mL として追加されます)、(200 mg/100 mL の水溶液原液 10 mL として追加) 20 mg ウラシルを混合することによってグルコースとガラクトースのメディアを準備します。、60 mg ロイシン (1 g/100 mL 水原液 6 mL として追加されます)、および脱イオン水濾過 (0.2 μ m フィルター) により 1 l. 定置滅菌の最終巻に 20 mg ヒスチジン (1 g/100 mL 水原液 2 mL として追加されます)。メディアは、数週間の 4 ° C で保存できます。 準備のエストラジ オール (E2) 基準に無水エタノールと適切な作業濃度に希釈溶解粉 E2 (2,275億 nM & 9.75 nM) 50% エタノールで。注: エストラジ オール 1 mg のバイアルとして購入した場合は、エストラジ オールの粉末を溶解するバイアルに直接 1 mL のエタノールを追加します。3.67 mM 在庫 #1 が得られます。 株式 #1 990 μ L エタノール 36.71 μ M 株式 #2 の 1 mL の 10 μ L を希釈します。 その後、株式 #2 990 μ 50% エタノール 367.13 nM 株式 #3 の 1 mL の 10 μ L を希釈します。 株式を働いているは、希釈 619.7 μ L 株式 #3 380.3 μ L 50% エタノール 1 mL 227.5 nM 在庫 ERα を表現する酵母の標準曲線を作成するために使用します。 26.56 μ L 株式 #3 9.75 nM 在庫 ERβ を表現する酵母の標準曲線を作成するために使用の 1 mL に 973.44 μ L 50% エタノールで希釈します。パラフィルム-20 で店と基準をシールまたは-70 ° C注意: E2 は疑い発がん性、生殖毒性物質です。吸入、飲み込んだ、または皮膚を通して吸収すると有害です。E2 授乳子供や胎児に害があります。E2 は水生生物に非常に有害です。適切な個人用保護具 (手袋、ヒューム フード、防塵マスク) を使用し、妊娠・授乳期の暴露を避けます。E2 有害廃棄物としての処分し、環境に解放しないでください。 最終的に脱イオン水で 8.52 g Na2HPO4、5.52 g NaH2PO4•H2O、95.21 mg MgCl2、745.5 mg KCl、2 g N lauroylsarcosine ナトリウム塩と ONPG (400 mg) または CPRG (77.7 mg) を混合することにより LacZ バッファーを準備します。20 mL 因数-20 ° C で 1 l. ストア LacZ バッファーのボリューム注: 20 mL 分注 1 の 96 ウェル プレート十分です。 105.9 g 室温 1 l. 店の最終巻に脱イオン水に炭酸ナトリウムを混合することにより炭酸ナトリウムを準備します。 水で 1 M ジチオトレイトール (DTT) を準備します。-20 ° C で DTT の 25 μ L の因数を凍結します。注意: DTT は急性皮膚および眼の刺激です。適切な個人的な保護装置 (手袋、ヒューム フード、防塵マスク) を使用して、皮膚と眼との接触、吸入や摂取を避けるために。注: 各因数は 1 つの 96 ウェル プレート十分です。 2. 試料と抽出コントロールの準備 テストするサンプルを選択します。注: この記事は、石鹸、クリーム、シャンプー、日焼け止め、リップ クリーム、財団、シェービング クリーム、マニキュア、ローションを含む 15 の PCPs のデータを示します。 15 mL の円錐管に無水エタノール 10 mL とサンプルの 1 g を組み合わせます。15 mL コニカル チューブ中のエタノールの 11 mL から成る負抽出コントロールを準備します。必要に応じて、複製を準備します。注: 提示の実験的なデザインのすべての 15 の PCPs と帳票抽出制御ソリューションの 3 つの因数を作製した、48 サンプルの合計 3 通のセクション 4 のプロトコルを使用してそれぞれを行った.一枚の板をトリプリケートで最大 23 サンプルに対応できます。無水エタノールは、それがすぐに蒸発するので、この手順で使用されます。否定的な抽出コントロールを使用すると、エストロゲンが円錐管からのサンプルに溶出しないことを確認してください。 手動振動とボルテックスの組み合わせによってまたは多管 vortexer でチューブを揺することによってチューブ内容 30 分間ホモジナイズしてください。 遠心分離機 10 分デカント バケット遠心分離機の最大許容速度で円錐管各チューブから清 40 μ m 携帯こし器を通って 50 mL の円錐管に。シンチレーション バイアルに各 50 mL のチューブの中身を空けます。 完全に蒸発し、エタノールを許可する 1 週間換気フードで残してバイアルを開きます。また、回転蒸発器、窒素下換気フードのサンプルを乾燥させます。光の敏感な成分の劣化を避けるためには、(例えば、換気フードのドアの上の場所不透明生地) の光から乾燥試料を保護します。 50% エタノールと均質化する渦の 1.0 mL のサンプルを再構成します。 3. 培養と二次培養酵母14 30 ° C でフィルター滅菌グルコース メディアにおける酵母の孵化によってアクティブなイースト文化 (出芽酵母14の組換え株 W303a) を維持します。サブカルチャー酵母毎週新鮮なフィルター滅菌グルコース メディアで。 2 泊 (約 42 h) はいプレートを準備する前にアクティブなイースト文化の 0.1 mL を 10 mL を無菌フィルター滅菌グルコース メディアに追加することによって酵母のサブカルチャー。 30 ° C で 2 泊分間インキュベートします。 酵母は、浅い文化として滅菌 250 mL エルレンマイヤー フラスコ場合、揺れは必要ありません。注: 酵母も格納できます冷蔵寒天版で数ヶ月。長期的なストレージの (年) が 15-50% 滅菌グリセリン、渦、-70 ° C で凍結と O/N 文化を組み合わせる滅菌グリセリンを準備、緩めたキャップ クリオバイアル、オートクレーブに 300 μ L グリセロールを転送するのに注射器を使用します。1,200 μ O/N 酵母培養生殖不能の技術を使用して追加します。 4. 準備はいプレート (アッセイの 1 日) 610 で 0.065 ± 0.005 の光学濃度 3.2 から酵母を希釈滅菌ビーカーおよび生殖不能の技術を使用して、フィルター滅菌ガラクトース メディア (外径610) nm。 透明なポリスチレン板に帳票ガラクトース ブランクと一緒に 3 通各酵母サンプルの 120 μ l 分注光学密度を確認 (プレート滅菌する必要はありません)。 プレート分光光度計を使用して、希釈酵母培養酵母のネット外径610を決定する酵母外径610測定値からガラクトース ブランクの 0.065 ± 0.005 減算 OD610 朗読のネット外径610があることを確認します。各 96 ウェル プレートの少なくとも 30 mL 希釈酵母の最終的なボリュームを準備します。注: この測定に 595 610 nm の吸光度を測定する分光光度計フィルターが使えます。おおよそ 1:6 v: v 比酵母: メディアの通常利回り 0.065 近く外径610 、だから 30 mL メディアに 4.5 mL 酵母を追加して起動し、0.060 と 0.070 netOD610を達成するために必要に応じてより多くの酵母やメディアを追加します。 生殖不能の技術を使用して、生殖の井戸、ポリプロピレン、プレート レイアウト (図 1) によると 96 ウェル マイクロ プレートにこの希釈酵母懸濁液を追加します。ピペッティング、間には、継続的にコンテナーを旋回またはピペットとの混合によって中断酵母ソースを保持します。このステップでは、滅菌注射器先端で繰り返し pipettor を使用することをお勧めします。注: ポリプロピレン プレート滅菌はオートクレーブ 2 つ重ね板箔に包まれています。 トップ プレート サンプル プレートの蓋として、洗浄、再オートクレーブすることができます、再利用します。 120 μ L フィルター滅菌ガラクトース メディアをプレート レイアウト (図 1) によると 3 追加井戸 (H10 – 12) に追加します。これらの井戸は、単独でのメディアによって貢献した吸光度を考慮してメディア コントロールとして機能します。 直列 E2 作業標準のトリプリケート希釈することによって各プレートの標準曲線を作成 (2,275億 9.75 ERα nM ERβ nM) 井戸酵母懸濁液 (A1 – G3) プレート レイアウト (図 1) によるとを含みます。 A3 から A1 の井戸に E2 の基準の 5 μ L を追加することによって始めます。ピペッティングによるマイクロウェル内容をミックスし、井戸 A1 – 井戸 B1 – 3 に 3 から 205 μ L を移動することによってこの懸濁液を連続希釈します。混合と列 G. を 205 μ L の転送を繰り返す注: シリアル希釈後、G1 – 3 の井戸から 205 μ L を破棄します。この手順の最後に、すべての標準的な井戸は 120 μ L を含める必要があります。シリアル希釈表 1に記載されている最終の E2 濃度が得られます。シリアル希釈手順については、滅菌のヒントでマルチ チャンネルの pipettor を使用することをお勧めします。 酵母懸濁液 (H1 – 3) プレート レイアウト (図 1) によるとを含む車両制御井戸に車両 (50% エタノール) の 5 μ L を追加します。注: 車両制御井戸、酵母とメディアに関連付けられたバック グラウンドの吸光度を定量化する使用されます。さらに、サンプルの外径610値を比較することにより検出できるテストの細胞毒性または成長促進効果は車両制御井戸と井戸をテストします。 プレート レイアウト (図 1) によると酵母懸濁液を含む井戸に 5 μ L をトリプリケートのサンプルおよび否定的な抽出コントロールを追加します。注: を書き留めますサンプルまたは否定的な抽出コントロールを追加するのも。 追跡するには、どの井戸があるサンプルとそうでない、ヒントの新鮮なボックスで開始およびプレートに対応する井戸の場所としてボックスで同じ場所からのヒントを使用します。1 つの 96 ウェル プレート 3 通まで 23 サンプルに対応できます。 ピペッティングでサンプル抽出制御、車両制御井戸の内容をミックスします。第 1 図の凡例に従ってそれぞれから 205 μ L を削除することによってこれらのウェル 120 μ L のボリュームを調整します。 滅菌、接着剤、多孔質フィルムとプレートをシールします。板にラベルを付けるし、30 ° C で 17 時間インキュベートプレートが潜伏中に動揺する必要はありません。 5. 処理はいプレート (アッセイの 2 日目) 30 ° C で 17 時間培養後インキュベーターからプレートを削除します。プレートがすぐに処理され場合、は、5.1.1 のステップへ進みます。プレートは、後日処理されます、5.1.2 のステップに進んでください。 井戸の各行の内容をミックス マルチ チャンネル pipettor を使用し、明確なポリスチレン、96 ウェル マイクロ プレートの対応する各ウェルから酵母懸濁液の 50 μ L を転送します。注: ポリスチレン板は無菌である必要はありませんが、蓋がなければなりません。ヒントだけ 3 連セットの間で変更する必要はトリプリケート全体 8 先端マルチ チャンネル ピペットでピペッティングしている場合が井戸の行ごとに新しいピペット先端を使用して、井戸、クロス汚染を避けるために。 新しい板にラベルを付けます。5.2 手順に進みます。 処理する前にプレートを格納するには、それらをラップで包み。冷蔵 6 4 ° C でラップされたプレート d. その後、冷蔵庫からプレートを削除、それらの包みを開ける、5.1.1 のステップのようにピペッティングによるすべての井戸の内容を転送します。5.2 手順に進みます。 1 M の DTT の 20 μ L を 20 mL の最終濃度 1 mM DTT の解凍の室温 LacZ バッファーに追加します。よくミックス LacZ のバッファー。マルチ チャンネル ピペットを使用している場合は、試薬リザーバーに分配します。注意: は、手袋を着用し、可能であれば、フードの DTT の作業 どちらかマルチ チャンネル ピペットを使用してまたは pipettor を繰り返し、ポリスチレン板のすべての井戸に DTT と ONPG または CPRG を含む LacZ バッファーを 200 μ l 添加し、すぐに測定し、プレート分光光度計を使用してすべての井戸の外径610を記録します。その他板の必要に応じて繰り返します。注: 外径610朗読、LacZ 計算 (ステップ 6.1) の分母に使用されます。このため、測定値を取得するピペッティングした後すぐに、セルの解決する前にまたは LacZ バッファーによって分離します。サンプル井戸の外径610値は著しく高いか車両制御井戸外径610の値より低い場合、サンプル抽出物は、成長促進や酵母、細胞それぞれ。計算は違いがどちらの方向に 30% を超える場合は、井戸に細胞の密度のわずかな違い、矯正する LacZ 追加 50% エタノール (ステップ 2.6) から再構成されたサンプルを希釈し、3.2 の手順に戻って、サンプルを再テスト12。 蓋付きプレートをカバーします。その特急 ERα14 (ONPG) 40 分または 3 h (CPRG) 30 ° C で酵母を含んでいる版を孵化させなさい。その特急 ERβ14 (ONPG) 70 分または 4 h (CPRG) 30 ° C で酵母を含んでいる版を孵化させなさい。注: CPRG の操作、インキュベーション時間が柔軟性があります。2 4 時間インキュベート アッセイ感度増加長い孵化と両方の受容体を持つ適切な結果が得られます。 プレートをインキュベート後マルチ チャンネル ピペットまたは繰り返し pipettor を各ウェルに 100 μ L の炭酸ナトリウムを追加するのに使用します。炭酸ナトリウムは pH を発生させ、β-ガラクトシダーゼの反応を停止します。 測定し、OD405 (ONPG) のまたは OD574 (CPRG) 用プレート分光光度計を使用してすべての井戸の記録。 6。LacZ の値を計算します。 注: LacZ 値各サンプルの色変化の度合いを定量化していくつかの変数の別の試金の間で値を比較する正規化された方法を提供 (例えば酵母の光学密度、メディア光学密度、およびインキュベーション時間の場合これは同じプレート上の井戸の中で異なる)12。 メディア (ガラクトース) 制御井戸 (H10-12) の帳票の外径610値の平均を計算し、帳票の OD405または車両 (50% エタノール) コントロール (H1-3) の OD574値の手段を計算します。プレートの時間でのこれらの手段と培養時間 (t) をすべて標準の LacZ の値 (各ウェルで色変化の度合いに対応) を計算する (ステップ 5.5) の色を変更する使用し、サンプルは、次の数式を使用して井戸します。 また、付録 1の標準およびサンプルの LacZ の値を計算するのに自動アプリケーションを使用します。注: アプリケーションに使用されるプレート レイアウトは図 1で示したプレート レイアウトと同じ必要があります。いくつかのサンプルの井戸を使用しない場合は、付録 1 LacZ のアプリケーションに貼り付けられない吸光度データセット内のプレース ホルダーとして空の井戸から吸光度の測定値を保持します。 これはアプリケーションでプレートの空間のレイアウトが保持され、メディア コントロール井戸が必要な場所にあることを保証します。 さらに、空のセルがある場合、アプリケーションは実行されません。 各 E2 標準の各サンプル帳票の LacZ の値の平均を計算します。LacZ の平均値を μ L-1と報告 h-1。標準的なそれぞれの E2 濃度を対数変換し template.csv ファイル (付録 2) のように書式設定されたスプレッドシート ドキュメントを生成します。 7. 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰を使用してサンプル エストラジ オール等価 (EEQs) の補間 注: EEQs は LacZ のサンプル値 (色変更) E2 で作成した標準曲線の LacZ の値に関連しています。EEQs はこのように、どのくらいのサンプルは E2 の濃度を既知として同じ色の変更の応答を引き出すために必要な決定します。 テスト サンプルの EEQs を計算するには、最初標準の曲線をプロットします。E2 標準 (y 軸) と、対応するログ変換 E2 濃度 (x 軸) 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰モデルにフィットの平均 LacZ の値。 モデルを使用して、テスト サンプル LacZ 値に EEQs を補間します。付録 2に記載されている統計解析ソフトウェアを使用して EEQs のロジスティック回帰計算を実施します。 8. PCP サンプル質量 EEQs (ng/mL) の標準化 EEQs を PCP サンプルに追加量に関連する各 4.5 の手順でよく容量サンプル井戸 (325 μ L) にメッキを EEQ (ng/mL) を掛けます、追加抽出したサンプルの量で割ります (5 μ L) も。注: これらの値は、抽出されたサンプルの mL あたり EEQ を表します。サンプルは、PCP の 1 g を使用して準備された、これらの値は PCP (ng/g) の 1 グラムあたり EEQ も表します。この方法で表される EEQ 値 (ng/g) を比較できる PCPs。 EEQ (ng/g) の異なる値間で今回テストしたパーソナルケア製品、テーブル 2に示すように、プロトコル全体の中で収集されたサンプル データをに含まれています。付録 3。