JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Обнаружение эстрогенных лигандов в продуктах личной внимательности с использованием дрожжей эстроген экран оптимизирован для лаборатории обучения студентов

Published: January 01, 2018
doi:
10.3791/55754
, , , , ,
1Department of Biology,University of the South, 2School of Biological Sciences,Louisiana Tech University, 3School of Medicine,Louisiana State University Health Sciences Center, 4Department of Biology,Furman University, 5Department of Computer Science,Louisiana Tech University, 6Clemson University

Summary

Эта статья содержит эстроген экран оптимизирован дрожжей для количественной оценки лигандов в продуктах личной внимательности (винтовых), которые связывают эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) и/или бета (ERβ). Этот метод включает в себя два варианта колориметрические субстрата, охлажденных инкубации шесть дней для использования в бакалавриату курсы и статистические инструменты для анализа данных.

Abstract

Дрожжи экран эстрогена (YES) используется для обнаружения эстрогенных лигандов в пробах окружающей среды и широко применялся в исследованиях эндокринных нарушений. Эстрогенных лигандов включают природного и техногенного характера» экологические эстрогены» (ЕЭС) в многих потребительских товаров, включая товары личной гигиены (винтовых), пластмасс, пестициды и продукты. ЭЭС нарушить гормонов сигнализации в организме человека и других животных, потенциально снижение рождаемости и увеличение риска заболеваний. Несмотря на важность ЕЭС и другие эндокринные нарушения химических веществ (ЭЭС) для общественного здравоохранения эндокринных обычно не входит в учебные программы бакалавриата. Этот недостаток частично объясняется отсутствием деятельности соответствующих лабораторий, которые иллюстрируют принципы участвуют также будучи доступным для студентов. Эта статья представляет оптимизированный Да для количественной оценки лигандами в личной гигиены, которые связывают эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) и/или бета (ERβ). Этот метод включает в себя один из двух колориметрические субстратов (Орто– нитрофенил-β-D-галактопиранозид (ONPG) или хлорфенол красно β-D-галактопиранозид (CPRG)), расщепляется, β-галактозидазы, шаг 6-дневный охлажденных инкубации облегчить использование курсов бакалавриата лаборатории, Автоматизированные приложения для вычисления LacZ и код R для анализа связанных 4-параметр логистической регрессии. Протокол был разработан чтобы позволить студентов разрабатывать и проводить эксперименты, в которых они экране продуктов по их выбору для мнемосхемы эстрогена. В процессе они узнают о эндокринной, культуры клеток, связывания рецептора, активность фермента, генной инженерии, статистики и экспериментальный дизайн. Одновременно, они также практикуют фундаментальных и широко применимые Лаборатория навыки, такие как: расчет концентрации; принятия решения; демонстрируя стерилизации; серийно, разведение стандартов; строительство и интерполяции стандартных кривых; Определение переменных и элементов управления; сбора, Организации и анализа данных; Построение и интерпретация графиков; и с использованием общих лабораторного оборудования, таких как micropipettors и спектрофотометров. Таким образом реализация этот assay поощряет студентов участвовать в запрос ориентированного обучения при изучении возникающих проблем в области экологической науки и здравоохранения.

Introduction

Дрожжи экран эстрогена (да) широко используется для количественного определения лиганды, которые имитируют эстрадиола (Е2 или 17β-эстрадиола) в различных матриц, включая воду, растительных тканей, потребительские товары и продукты1,2,3, 4. Коллективно такие лигандов называются «Экологические эстрогены (ЭЭС).» Да, первоначально была разработана как низкая стоимость, в пробирке альтернативой в естественных условиях испытания как грызун Утеротропная пробирного5,6 и радужная форель, кормления пробирного7. Цель этих испытаний заключается в определении, если продукт содержит химические вещества, которые стимулируют или блокировать эстроген зависимых механизмов. Обнаружение EEs имеет решающее значение, потому что они могут мешать нормальной эндогенных эстрогенов, сигнализации, особенно во время внутриутробного развития. Это вмешательство подрывает здоровье, увеличивая риск ожирения, бесплодие, рак и когнитивные потери8.

Несмотря на важность ЕЭС и другими ЭЭС для общественного здравоохранения эндокринных обычно не входит в учебные программы бакалавриата. Отчасти из-за недостатка деятельности, которые иллюстрируют принципы этот недостаток участвует также будучи доступным для студентов. Кроме того существует несколько вариантов протокола да9,10,11,12,13, и это разнообразие делает пробирного оптимизации времени для Лаборатория координаторы не специально обученных в соответствующих методов. Наконец да анализов обычно комплектуются более 1 длинный день или 2 дня подряд с O/N инкубации. Это время не совместим с форматом Бакалавриат лабораторных курсов, которые обычно отвечают раз / неделя в течение нескольких часов.

В ответ на эти нужды эта рукопись сообщает оптимизированный протокол да 96-луночных, который включает обколоть извлечения методы для личной гигиены (винтовых)3 и 6-дневный холодильного шаг для размещения еженедельных совещаний лаборатория. Абсолютного этанола является универсальным органического растворителя, который может распустить целый ряд полярных и неполярных растворенных веществ. Кроме того это подходит для студентов курсов, потому что это легко доступны, относительно нетоксичны, доступным и смешивается с водой; Он также легко испаряется без специального оборудования. Однако этанола не является идеальным для извлечения сильно гидрофобной эндокринные расстройства или много масла и воски, последние две общие ингридиенты в винтовых. бедные извлечения эффективности повышает риск возникновения ложных отрицательных результатов. Это ограничение в виду следователи должны выбрать процедуры извлечения (например, обколоть извлечения или извлечения твердой фазы), адрес образец характеристики и целей исследование (исследование против студентов инструкция).

Да опирается на рекомбинантной Saccharomyces cerevisiae , первоначально созданные д-р Чарльз Миллер в Туланском университете. Пожалуйста, смотрите Миллер и др. (2010) для полной карты инженерии плазмида14. Дрожжи преобразован с этих плазмидов конститутивно Экспресс человека ядерных ERα или ERβ (также называемый ESR1 и ESR2, соответственно) при выращивании в средствах массовой информации, содержащие галактозу (для ERα) или глюкозы или галактозы (для ERβ). Если эстрогенные химические вещества присутствуют в средствах массовой информации, они связываются с рецепторами, создавая рецептор лиганд комплексы, которые активируют β-галактозидазы (lacZ) выражение на уровне пропорционально концентрации химических веществ, эстрогенные. Дрожжевые клетки затем лизированы выпустить накопленную β-галактозидазы. Буфер lysis содержит ONPG или CPRG, которые являются расщепляется β-галактозидазы приносить желтые или красные продукты, соответственно. Колориметрические продуктов могут быть количественно путем измерения оптической плотности, используя спектрофотометр микрорезервуар пластины. Степень изменения цвета пропорциональна концентрации эстрогенных лигандов, которым подвергалась дрожжей.

Выбор субстрата (CPRG или ONPG) зависит от возможности для поглощения фон, вытекающих из образцов. Например, экстракты растений часто будет добавить желтый оттенок в СМИ, что искусственно раздувает estrogenicity меры, если ONPG (количественно в 405 нм) используется в качестве субстрата для β-галактозидазы. С растительные экстракты, CPRG (количественно в 574 nm) может быть более подходящим колориметрические субстрата. CPRG является более дорогим, чем ONPG, но на одну десятую Молярность используется. Эта статья представляет estrogenicities ПХФ количественно с помощью ONPG и CPRG экстрактов.

Количественная оценка estrogenicity проб окружающей среды с помощью ERα и ERβ является более комплексный подход, чем при использовании только одной из этих рецепторов. В животных эти рецепторы exhibit дифференциальной тканей распределение, регулирования деятельности и сходство привязки для эстрогенных и анти-эстрогенных лигандов15. Например на основе завод phytoestrogens обычно привязывают ERβ более решительно2, тогда как синтетических химических веществ может показать предпочтение ERα или ERβ или можно связать оба одинаково хорошо рецепторов15. Таким образом привязка к одной эстрогенового рецептора не обязательно предсказать привязки на другой.

Хотя во многих потребительских товаров (например, пестициды, моющие средства, клеи, смазочных материалов, пластмасс, продукты и фармацевтика) а также растения найдены EEs, представленные данные были получены с помощью выбор винтовых. винтовых являются убедительными, легко доступные, бюджетный и экологически значимых для студентов. Студенты могут быть приглашены принести свои любимые винтовых из дома для тестирования в лабораторных условиях. Они могут также поиск по базе кожи глубоко разработанной окружающей среды Рабочая группа16 генерировать гипотеза driven сравнения винтовых с высокой и низкой токсичности баллы. Таким образом студенты могут одновременно развивать передовые лаборатории навыки; заниматься самостоятельной, запрос основе обучения; и изучение новых вопросов в области экологической науки и здравоохранения.

Protocol

1. для приготовления реагентов Подготовить глюкозы и галактозы СМИ, смешивая 6,7 г дрожжей азота базы, 20 г декстрозы или галактозы, 20 мг аденин сульфат (Добавлено как 10 мл, 200 мг/100 мл водного раствора запасов), 20 мг урацилом (Добавлено как 10 мл, 200 мг/100 мл водного раствора акций) , 60 мг лейцина (Добавлено как 6 мл, 1 г/100 мл водного раствора запасов) и гистидина 20 мг (Добавлено как 2 мл, 1 г/100 мл водного раствора акций) в деионизированной воде окончательный объемом 1 л Стерилизируй-отпусти путем фильтрации (фильтр 0.2 мкм). Средства массовой информации могут храниться при температуре 4 ° C на несколько недель. Подготовить эстрадиола (Е2) стандартов путем растворения порошка E2 в безводном этаноле и разбавления до соответствующих рабочих концентрациях (227,5 Нм & 9,75 Нм) в 50% этанола.Примечание: Если эстрадиола куплен как флакон 1 мг, добавьте 1 мл этанола непосредственно флакона растворить порошок эстрадиола. Это дает 3.67 приклад #1.  Развести 10 мкл акций #1 990 мкл этанола сделать 1 мл 36.71 мкм фондовой #2.  Затем разбавьте 10 мкл акций #2 990 мкл 50% этанола сделать 1 мл 367.13 Нм фондовой #3.  Чтобы сделать рабочие запасы, развести 619.7 мкл фондовой #3 в 380.3 50% этанола мкл сделать 1 мл 227.5 Нм работы запаса используется для создания стандартных кривых с дрожжами, выражая ERα.  Разбавьте 26.56 мкл фондовой #3 в 973.44 50% этанола мкл сделать 1 мл 9,75 Нм работы Фонда используется для создания стандартных кривых с дрожжами, выражая ERβ. Уплотнение стандартов с парафина и хранить в -20 или -70 ° C.Предупреждение: E2 — подозреваемых канцерогенов и репродуктивную функцию. Это вредно при вдыхании, проглотил, или всасывается через кожу. E2 может причинить вред для грудного вскармливания детей и плодов. E2 является весьма токсичным для водных организмов. Использовать соответствующие личной защиты (Зонта, перчатки, маску от пыли) и избегать воздействия во время беременности и лактации. Распоряжаться E2 как опасные отходы и не выделяют в окружающую среду. Подготовка LacZ буфера путем смешивания 8.52 g Na2HPO4, 5.52 g NaH2PO4•H2O, 95.21 мг MgCl2, 745.5 мг KCl, натриевая соль 2 g N-lauroylsarcosine и ONPG (400 мг) или CPRG (77,7 мг) в деионизированной воде финал объем 1 л магазина LacZ буфера в 20 мл аликвоты при-20 ° C.Примечание: 20 мл аликвота достаточно для одного 96-луночных пластины. Подготовить карбонат натрия, смешивая 105.9 g карбонат натрия в деионизированной воде окончательный объемом 1 л магазина на RT. Подготовка 1 M Дитиотреитол (DTT) в воде. Заморозить 25 мкл аликвоты DTT в-20 ° C.Предупреждение: DTT — острый кожи и глаз раздражитель. Используйте соответствующие СИЗ (Зонта, перчатки, маску от пыли), чтобы избежать кожу и глаза, ингаляции и при приеме внутрь.Примечание: Каждый Алиготе достаточно для одного 96-луночных пластины. 2. Подготовка образцов и извлечения элементов управления Выберите образцы для тестирования.Примечание: Эта статья представляет данные для 15 винтовых, включая мыло, крем для волос, шампунь, солнцезащитный крем, бальзам для губ, Фонд, крем для бритья, лак и лосьон. Объединить 1 g образца с 10 мл безводного этилового спирта в 15 мл Конические трубки. Подготовьте отрицательный извлечения управления, состоящий из 11 мл этанола в 15 мл Конические трубки. Подготовьте реплицирует при необходимости.Примечание: Для представленных экспериментальный дизайн, три аликвоты всех 15 винтовых и тройные извлечения решения управления были подготовлены, давая в общей сложности 48 образцов, каждый из которых был проанализирован в трех экземплярах, с использованием протокола в разделе 4. Один плиты могут разместиться до 23 образцов в triplicates. Безводный этанол используется в этот шаг, потому что он легко испаряется. Используйте отрицательные извлечения элементов управления для проверки, что эстрогены не являются выщелачивания в пробах конические трубы. Однородный содержимое трубки для 30 мин комбинацией ручного встряхивания и vortexing или путем встряхивания трубы на Вортекс мульти трубки. Центрифуга конические трубы на максимальной допустимой скорости в центрифугу ведро 10 мин Decant супернатант от каждой трубы через стрейнер клеток 40 мкм в 50 мл Конические трубки. Пустое содержимое каждого Тюбик 50 мл во флаконе сцинтилляционные стекла. Флаконов отпуск открыть в вентилируемых капот на одну неделю позволить этанола не испарится полностью. Кроме того сухие образцы в вентилированные капюшон под азота или роторный испаритель. Чтобы избежать деградации света чувствительных составляющих, защите от света (например, место непрозрачной ткани над дверью вентилируемого капота) сушки проб. Восстановить образцы в 1,0 мл 50% этанола и вихревые для гомогенизации. 3. культивирование и Subculturing дрожжи14 Поддерживать активные дрожжи культуры (рекомбинантный штамм W303a S. cerevisiae14) по инкубации дрожжи в средствах массовой информации фильтра стерилизации глюкозы при 30 ° C. Субкультура дрожжи еженедельно в средствах массовой информации свежей стерилизовать фильтр глюкозы. Две ночи (около 42 h) до подготовки да пластины, субкультура дрожжи путем добавления 10 мл фильтр стерилизации глюкозы носителей с помощью стерильных 0,1 мл культур дрожжей.  Инкубируйте на 30 ° C на две ночи.  Пожимая не является обязательным, если дрожжи выращиваются как мелкий культур в 250 мл стерильного Эрленмейер колбы.Примечание: Дрожжи могут также храниться на охлажденных агар пластины на несколько месяцев. Для более длительного срока хранения (лет), объединить O/N культур с 15-50% стерильный глицерина, вихрь и заморозить в 70 ° C. Для подготовки стерильные глицерина, используйте шприц для передачи 300 мкл глицерина в cryovial и автоклав с крышкой ослабла. Затем добавьте 1200 мкл O/N дрожжевая культура с использованием метода стерилизации. 4. Подготовка да пластины (день 1 проба) В стерильные стакан и используя стерильную методику, развести дрожжи из шага 3.2 оптической плотности 0,065 0,005 в 610 Нм (610ОД) в средствах массовой информации фильтра стерилизации галактозы. Подтвердите оптической плотности, дозирования 120 мкл каждого образца дрожжей в трех экземплярах наряду с трех экземплярах галактозы заготовок в четкой пенополистирольные плиты (плита не нужно быть стерильной).  Используйте спектрофотометр пластины для проверки что разреженных дрожжевая культура имеет чистый ОД610 0,065 0,005 вычесть OD610 чтений галактозы заготовок из дрожжей ОД610 чтений для определения чистой ОД610 дрожжей. Подготовьте окончательный объем по крайней мере 30 мл разбавленной дрожжей для каждой пластины 96-луночных.Примечание: Спектрофотометр фильтры измерения оптической плотности между 595 и 610 Нм могут использоваться для этого измерения.Примерное соотношение 1:6 v: v дрожжей: СМИ обычно дает ОД610 недалеко от 0,065, так что начать с добавления дрожжей 4,5 мл 30 мл средства массовой информации и добавить больше дрожжей или средств массовой информации в случае необходимости для достижения netOD610 между 0,060 и 0,070. Используя стерильную методику, добавьте этот Разводненная дрожжи подвеска скважин стерильные, полипропилен, 96-луночных микропланшетов согласно структуре пластины (рис. 1). Во время закупорить, держите источник дрожжей, приостановлено постоянно крутятся контейнера или смешивания с пипеткой. Для этого шага это полезно использовать повторяющуюся дозаторов с наконечником стерильный шприц.Примечание: Полипропиленовых плит являются стерилизован автоклавированием две сложены пластины, завернутый в фольгу.  Верхняя пластина служит крышкой для образца пластины и может быть промывают, ре газобетона, повторно. Добавьте 120 мкл фильтр стерилизации галактозы СМИ 3 дополнительных скважин (H10 – 12) согласно структуре пластины (рис. 1). Эти колодцы служат СМИ контроля для учета поглощения, внесли в средствах массовой информации только. Построить калибровочной кривой в каждой пластинке разбавлением серийно triplicates E2 рабочих стандартов (227,5 Нм для ERα, 9,75 Нм для ERβ) в скважинах, содержащие дрожжи подвеска (A1 – G3) согласно структуре пластины (рис. 1).  Начните с добавлением 5 мкл E2 стандартов скважин A1 до A3. Смешать содержимое микрорезервуар, закупорить и серийно разбавления Эта подвеска, перемещая 205 µL из скважин A1 – 3 в скважины B1 – 3. Повторите смешивания и передачи 205 мкл через строку G.Примечание: После завершения серийный разрежения, отказаться от 205 мкл из скважин G1 – 3. В конце этого шага все стандартные скважины должен содержать 120 мкл. Серийный разрежения даст окончательный концентрации Е2, перечисленных в таблице 1. Для последовательного растворения шаги это полезно для использования многоканальных дозаторов с стерильных советы. 5 мкл транспортного средства (50% этиловом спирте), чтобы транспортное средство контроля скважин, содержащие дрожжи подвеска (H1 – 3) согласно структуре пластины (рис. 1).Примечание: Транспортного средства контроля скважин используются для количественного определения фона поглощения, связанные с дрожжевых клеток и СМИ. Кроме того цитотоксичности или роста поощрение эффектов испытаний Образцы могут быть обнаружены путем сравнения значений610 ОД испытания скважин с теми транспортного средства контроля скважин. Добавьте 5 мкл triplicates образцов и негативные извлечения элементов колодцев, содержащие дрожжи подвеска согласно структуре пластины (рис. 1).Примечание: Запишите которых образцы или отрицательные извлечения элементы управления добавляются к каждой скважины.  Чтобы отслеживать какие Уэллс имеют образцы и которые не, начать с коробкой свежие советы и использовать советы от тех же местах в поле как местоположения соответствующего скважин в пластине. Одна пластина 96-луночных могут разместиться до 23 образцов в трех экземплярах. Смешайте содержимое образца, извлечения элемента управления и транспортное средство контроля скважин, закупорить. Скорректировать объемы этих скважин до 120 мкл, удалив 205 мкл от каждого, как описано в легенде на рисунке 1. Уплотнение знаке с стерильной, клей, пористая пленка. Этикетке плиты и проинкубируйте 17 ч при температуре 30 ° C. Плита не нужно быть поколеблен во время инкубации 5. обработка Да пластины (день 2 проба) После 17 ч инкубации при температуре 30 ° C удалите пластины из инкубатора. Если плиты будет обработан немедленно, перейдите к пункт 5.1.1. Если плиты будут обрабатываться на более поздний срок, перейдите к пункт 5.1.2. Использование многоканальных дозаторов смешать содержимое каждой строки скважин и затем передать 50 мкл суспензии дрожжей из каждой скважины соответствующих и четких, полистирола, 96-луночных микропланшетов.Примечание: Полистирольные плиты не обязательно должны быть стерильными, но должен иметь крышку. Используйте новые советы пипетки для каждой строки скважин во избежание кросс загрязняют колодцы, хотя если закупорить через triplicates с 8-наконечник многоканальные пипетки, советы нужно только быть изменено между трех экземплярах наборов. Этикетке новой пластинкой. Перейдите к шагу 5.2. Для хранения пластины перед обработкой, оберните их в полиэтиленовую пленку. Охладите завернутый пластины при 4 ° C для 6 d., удалить пластины из холодильника, развертывать их и передавать содержимое всех скважин, закупорить как шаг 5.1.1. Перейдите к шагу 5.2. 20 мкл 1 М DTT, 20 мл талой, комнатной температуре LacZ буфера для конечной концентрации 1 мм DTT. Mix LacZ буфер хорошо. При использовании многоканальных дозаторов, обойтись в водохранилище реагента.Предупреждение: Надевайте перчатки и работать с DTT в капюшоне, если возможно С помощью либо многоканальные пипетки или повторяющиеся дозаторов, 200 мкл буфера LacZ, содержащий DTT и ONPG или CPRG для всех скважин пенополистирольные плиты и немедленно Измерьте и запишите ОД610 всех скважин, используя спектрофотометр пластины. При необходимости повторите для дополнительных пластин.Примечание: OD610 показания используются в качестве знаменателя LacZ вычисления (шаг 6.1). По этой причине, получить показания, сразу после закупорить и до оседают клетки или лизированы LacZ буфером. Если ОД610 значений для образца скважин заметно выше или ниже, чем ОД610 значений для транспортного средства контроля скважин, образец экстракты являются поощрение роста или цитотоксические дрожжей, соответственно. LacZ, расчет будет исправить небольшие различия в плотности клеток через скважины, но если различия превышают 30% в любом направлении, затем развести восстановленный образца (от шага 2.6) в дополнительные 50% этанола и повторного тестирования пример путем возвращения к шагу 3.2 12. Накладки с крышкой. Инкубируйте пластины, содержащие дрожжи что Экспресс ERα14 при 30 ° C для 40 мин (для ONPG) или 3 h (для CPRG). Инкубируйте пластины, содержащие дрожжи что Экспресс ERβ14 при 30 ° C для 70 мин (для ONPG) или 4 ч (для CPRG).Примечание: При работе с CPRG, инкубации раз являются гибкими; инкубации для 2-4 ч урожаи подходящие результаты с обоих рецепторов, с больше инкубаций увеличивая чувствительность анализа. После инкубации пластины, используйте многоканальные пипетки или повторяющиеся дозаторов для 100 мкл карбонат натрия в каждой скважине. Карбонат натрия повышает рН и останавливает β-галактозидазы реакции. Измерьте и запишите ОД405 (для ONPG) или574 ОД (для CPRG) всех скважин, используя спектрофотометр пластины. 6.Вычисление значений LacZ Примечание: Значения LacZ количественно оценить степень изменения цвета для каждого образца и предлагаем нормализованный метод сравнения значений среди отдельных анализов путем учета нескольких переменных (например, дрожжи оптической плотности, СМИ оптической плотности и инкубации время если Это отличается среди скважин на пластину же)12. Расчет средств тройные ОД610 значений для СМИ (галактозы) контроля скважин (H10-12) и рассчитать средства тройные ОД405 или ОД574 значений для элементов управления транспортного средства (50% этиловом спирте) (H1-3). Использовать эти средства и время инкубации (t) в часах для пластины для изменения цвета (шаг 5.5) для вычисления значения LacZ, (соответствующие степени изменения цвета в каждой скважине) для всех стандартных и образец скважин с помощью следующих уравнений: Кроме того применение автоматизированных в приложении 1 для вычисления значений LacZ стандарты и образцы.Примечание: Плита макет, используемый с приложением должно быть идентично макет пластины, представлены на рисунке 1. Если некоторые примеры скважины не использовались, сохраняют поглощения чтений из пустой скважин как место Держатели в наборе поглощения вставить в приложение LacZ, приложение 1 .  Это сохраняет пространственное расположение пластины в приложение и гарантирует, что средства массовой информации контроль скважины в нужное место.  Кроме того приложение не будет выполняться, если есть пустые ячейки. Рассчитайте средства тройные LacZ значений для каждого стандарта E2 и каждого образца. Доклад LacZ значения как мкл-1h-1. Журнал преобразование концентрации каждого стандарта E2 и создание документа электронной таблицы отформатирован как в файле template.csv (приложение 2). 7. интерполяции образец эстрадиола эквиваленты (EEQs) с помощью 4-параметр логистической регрессии Примечание: EEQs касаются LacZ значения калибровочной кривой, созданные с E2 образца LacZ значения (изменение цвета). EEQs таким образом определить, сколько образца требуется добиться такой же ответ изменения цвета как известной концентрации Е2. Для расчета EEQs для тестирования образцов, первый участок калибровочной кривой. Средняя LacZ значения посадки для E2 стандартов (ось y) и соответствующий журнал трансформированных E2 концентрации (ось x) к модели логистической регрессии четыре параметра. Используйте модель интерполировать EEQs для тестирования образцов LacZ значений. Проводить расчет логистической регрессии EEQs с использованием статистического программного обеспечения, как это предусмотрено в добавлении 2. 8. Стандартизация EEQs (нг/мл) до массы образца PCP Увязать количество PCP образец добавляется EEQs каждый хорошо в шаге 4.5, умножить объем покрытием в образце скважины (325 мкл) EEQ (нг/мл) и затем разделить на объем извлеченной выборки добавлены для каждой скважины (5 мкл).Примечание: Эти значения представляют EEQ мл извлечения образца. Если образцы были подготовлены с использованием 1 g PCP, эти значения также представляют EEQ на грамм PCP (нг/г). Выражены таким образом, значения EEQ (нг/г) можно сравнить через различные значения винтовых. EEQ (нг/г) для продуктов личной гигиены, протестированы в этом исследовании приводятся в таблице 2, и образцы данных, собранных на протяжении всего протокола включены в Добавление 3.

Representative Results

Estrogenicities тройные образцов 15 винтовых были оценены, используя этот протокол да. Как отметил Миллер и др. (2010), анализов с дрожжами, выражая ERβ были более чем на порядок более чувствительны, чем анализов с дрожжами, выражая ERα (рис. 2)14. Таким образом эстрогенная активность чаще была обнаружена с ERβ-выражая дрожжей (Таблица 2). Восемь винтовых выставлены эстрогенная активность с ERβ и 5 винтовых выставлены эстрогенная активность с ERα. Крем для волос, солнцезащитный крем, лосьон и губы бальзам образцы были эстрогенных с обоих рецепторов, тогда как фонд, крем для бритья и лак только эстрогенных с ERβ протестированных концентраций. Семь других винтовых (4 шампуни, 2 мыла и бальзам для губ 1) не были эстрогенных с либо рецептор на протестированных концентраций. Помимо различий чувствительность рецепторов EEQs для каждого образца различалось в зависимости от колориметрические субстрата (ONPG или CPRG) используется в assay (Таблица 2). Во всех, кроме одного образца EEQs, определяется с использованием ONPG были выше, чем те, которые определены с помощью CPRG. Кроме того различия между добычей реплицирует низкие для EEQs с ERβ и CPRG и определяется максимальным для EEQs с ERα и ONPG (Таблица 2). Помимо сравнения колориметрические субстратов, 1 Цель настоящего исследования было проверить инкубации раз продолжительности, которые совместимы с графиком курс бакалавриата лаборатории. Типичный да assay требует 17 ч инкубации сразу же после инкубации в LacZ буфер для 40 мин – 4 h, график, который невозможно осуществить в лаборатории обучения ограничены одной еженедельной сессии. Для облегчения использования этот assay в обучении, проба была изменена путем введения периода охлаждения 6 d (шаг 5.1.2) после инкубации 17 h. Стандартные кривые из холодильных плит были сопоставимы с от неохлажденных пластины (рисунки 2 & 3), за исключением того, что все были стандартные ошибки параметров, с помощью модели логистической регрессии 4 параметр меньшие для охлажденных пластины, чем для nonrefrigerated пластин (Таблица 3). Таким образом охлаждение пластины для 6 d уменьшает ошибки и улучшает точность оценок EEQ. Рисунок 1. Пластина Microwell макет и стандартные разрежения кривой подготовки для Assay да. E2 стандартов (светло серые скважины), образцы и отрицательные извлечения элементов (белый скважины) и транспортных средств (H1 – 3) и галактозы СМИ (H10 – 12) контроля (тёмно серые скважин) были протестированы в трех экземплярах. Калибровочной кривой E2 (светло серые скважин) был построен покрытие 320 мкл дрожжей в скважины A1 по A3 и 120 мкл дрожжей в скважины B1 через G3. Затем, 5 мкл E2 (227,5 Нм для дрожжей, которые выражают ERα; 9,75 Нм для дрожжей, которые выражают ERβ) были добавлены к дрожжи в скважинах A1 до A3. Дрожжи + E2 подвеска серийно разводили путем передачи 205 мкл от каждой скважины к скважине ниже его, давая окончательный концентрации Е2, перечисленных в таблице 1. Обратите внимание, что, в конце процесса последовательного разрежения, 205 мкл должно быть удалено из скважин G1 через G3 для достижения окончательный объем 120 мкл в каждой скважине. Образец и негативные извлечения контроля скважин были готовы, добавив 5 мкл каждого (растворяют в 50% этиловом спирте) экстракт 320 мкл дрожжей. Транспортное средство контроля скважин (H1 – 3) были подготовлены путем добавления 5 мкл 50% этанола 320 мкл дрожжей. Все примеры и контроля скважин были неоднозначными, закупорить и 205 мкл были удалены и отбрасываются скорректировать хорошо томов 120 мкл. Наконец средства массовой информации контроля были подготовлены покрытие 120 мкл галактозы СМИ в скважины H10 – 12.  Использовать калькулятор LacZ в приложение 1 и приложение на основе R, описанной в добавлении 2, E2 калибровочной кривой и контроля транспортных средств и галактозы СМИ должны быть покрытием как показано.  Образцы и негативные извлечения элементов управления можно покрытием в любом из белого скважин до тех пор, как отмечено порядок покрытия.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Стандартные кривые для пластин Да, созданного с помощью логистической регрессии 4-параметрическую. Два субстратов (ONPG & CPRG) были протестированы с использованием дрожжей, выражая один из двух человека эстрогеновых рецепторов (ERα или ERβ) и без (A) и (B) 6 d холодильного периодом после 17 ч инкубации с 17β-эстрадиол и образец извлекает. Все стандарты E2 и средства массовой информации и транспортного средства управления были протестированы в трех экземплярах. Очки представляют собой средства значений тройные LacZ, где LacZ значения отражают степень изменения цвета, вызванные β-галактозидазы. В таблице 3перечислены параметры модели логистической регрессии. ONPG = Орто- нитрофенил-β-D-галактопиранозид; CPRG = хлорфенол красно β-D-галактопиранозид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Примеры развитых да плит. Два субстратов (ONPG & CPRG) были протестированы с использованием дрожжей, выражая человеческие эстрогеновых рецепторов (ERα или ERβ), либо без (слева) или с периодом (справа) холодильного шесть дней после 17 ч инкубации с 17β-эстрадиола или образец выдержки. Все стандарты E2, средства массовой информации и транспортного средства управления были протестированы в triplicates. Плиты были аранжированы с самой высокой концентрацией E2 в верхней строке каждой пластины и контроля (50% этанола + дрожжей на левой и галактозы СМИ справа) в нижней строке каждой пластины согласно рис. ONPG = Орто- нитрофенил-β-D-галактопиранозид; CPRG = хлорфенол красно β-D-галактопиранозид.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Стандартный номер [E2] для ERα дрожжей (pM) [E2] для ERβ дрожжей (pM) 1 3500 150 2 2208 94,6 3 1393 59.7 4 878 37,6 5 65W 23,7 6 349 15 7 220 9.45 Таблица 1. Окончательный концентрации Е2 стандартов используется в Да.Пудры E2 был распущен в безводном этаноле и затем разбавляют до рабочей запасов концентрации 227,5 Нм (для дрожжей, которые выражают ERα) и 9,75 Нм (для дрожжей, которые выражают ERβ) в 50% этанола.Рабочие запасы были затем добавляется Гонав скважин, содержащие дрожжи в СМИ галактозы и серийно разводили в концентрации, показано в таблице. Исследованных образцов Анализ условий Эстрогенных эквиваленты (EEQs) винтовых PCP # Тип образца Рецептор Субстрат EEQ 1 (нг/г) EEQ 2 (нг/г) EEQ 3 (нг/г) Значит EEQ (нг/г) 1 Крем для волос ERΑ ONPG ND 0,379 ND < 0,379 1 Крем для волос ERΑ CPRG ND ND ND ND 1 Крем для волос ERΒ ONPG 0.528 0,338 0.363 0.410 1 Крем для волос ERΒ CPRG ND 0.215 ND < 0.215 4 Солнцезащитный крем ERΑ ONPG 6.803 1.390 ND < 4.097 4 Солнцезащитный крем ERΑ CPRG ND ND ND ND 4 Солнцезащитный крем ERΒ ONPG 1,321 0.838 0.818 0.992 4 Солнцезащитный крем ERΒ CPRG 0.651 0.591 0,725 0.656 7 Фонд ERΑ ONPG ND ND ND ND 7 Фонд ERΑ CPRG ND ND ND ND 7 Фонд ERΒ ONPG ND 0,158 ND < 0,158 7 Фонд ERΒ CPRG ND ND ND ND 9 Бритья крем ERΑ ONPG ND ND ND ND 9 Бритья крем ERΑ CPRG ND ND ND ND 9 Бритья крем ERΒ ONPG ND 0,256 0.295 < 0,276 9 Бритья крем ERΒ CPRG 0.507 0.392 0.560 0.486 10 Лак для ногтей ERΑ ONPG ND ND ND ND 10 Лак для ногтей ERΑ CPRG ND ND ND ND 10 Лак для ногтей ERΒ ONPG 0.916 0.503 0,554 0.658 10 Лак для ногтей ERΒ CPRG 0.532 0.628 0.594 0.585 11 Лосьон ERΑ ONPG ND ND 2.327 < 2.327 11 Лосьон ERΑ CPRG ND ND ND ND 11 Лосьон ERΒ ONPG Превышает диапазон 2,599 1.845 > 2.222 11 Лосьон ERΒ CPRG — 1.986 1.236 1.611 13 Солнцезащитный крем ERΑ ONPG 14.069 11.494 10.189 11.917 13 Солнцезащитный крем ERΑ CPRG 4.773 5.790 5,850 5.471 13 Солнцезащитный крем ERΒ ONPG Превышает диапазон 2.580 Превышает диапазон > 2.580 13 Солнцезащитный крем ERΒ CPRG 0,292 0.240 ND < 0.266 15 Бальзам для губ ERΑ ONPG ND ND 0.431 < 0.431 15 Бальзам для губ ERΑ CPRG ND ND ND ND 15 Бальзам для губ ERΒ ONPG 1.202 1,060 0,887 1.050 15 Бальзам для губ ERΒ CPRG 0.820 0.871 0.851 0.847 В таблице 2. EEQs винтовых с нуля EEQs. Три аликвоты 15 винтовых и три извлечения элементов управления были гомогенизации в безводном этаноле, испаряется и воссоздана в 50% этанола для в общей сложности 48 образцов, каждый из которых был проанализирован в трех экземплярах, используя assay да. Восемь винтовых имел по крайней мере 1 EEQ не равно нулю, в то время как 7 винтовых не были найдены, чтобы быть эстрогенных протестированных концентраций. EEQ 1, EEQ 2 и EEQ 3 ссылаются на три аликвоты каждого PCP, каждого испытания в трех экземплярах на отдельной табличке. Значения для EEQ 1, EEQ 2 и EEQ 3 являются средствами triplicates для каждого Алиготе. Дрожжей используется в assay выразил 1 2 изоформ человека эстрогеновых рецепторов (ERα или ERβ). Две колориметрические субстратов, ONPG и CPRG, были протестированы с использованием неохлажденных протокола. EEQs были определены с помощью логистической регрессии 4 параметр (с R2 значения ≥ 0,98) LacZ значений в каждом из 7 концентрации Е2. ND = ниже предела обнаружения анализа.–= потерял реплицировать. Анализ условий Параметры модели Рецептор Субстрат Арест на 4 ° C на 6 d Модель R2 Темпы роста (LacZ единиц/нг/мл) Точки перегиба (нг/мл) Нижняя асимптоты (LacZ единиц) Верхняя асимптоты (LacZ единиц) ERΑ ONPG Нет > 0.99 8.548 ±1.633 -0.512 ±0. 025 -1.623 ±4.408 128.11 ±6.31 ERΑ ONPG ДА > 0.99 7.618 ±0.758 -0.587 ±0.014 -8.378 ±2.223 99.53 ±2.528 ERΑ CPRG Нет > 0.99 8.256 ±2.182 -0.610 ±0.033 0.853 ±3.333 62.52 ±3.473 ERΑ CPRG ДА > 0.99 5,068 ±0.616 -0.523 ±0.022 -3.147 ±1.946 68.06 ±3.069 ERΒ ONPG Нет > 0.99 1.041 ±2.004 -0.898 ±4.410 -32.98 ±86.62 248.6 ±778.9 ERΒ ONPG ДА > 0.99 4,327 ±1.289 -1.736 ±0.087 4.654 ±3.087 66.37 ±10.75 ERΒ CPRG Нет = 0,99 5.673 ±1.764 -1.914 ±0.052 3.925 ±1.679 28.05 ±2.334 ERΒ CPRG ДА > 0.99 4.412 ±1.142 -1.894 ±0.051 2.052 ±1.303 22.64 ±2.047 В таблице 3. Модели параметров 4-параметр логистической регрессии для стандартных кривых в Рисунок 2. Два субстратов, ONPG и CPRG, были протестированы с использованием дрожжей, выражая 1 2 человека эстрогеновых рецепторов (ERα или ERβ) как без, так и с периодом холодильного шесть дней после 17 ч инкубации. Параметры сообщается как оценки ±standard ошибок. Приложение 1. Приложение для расчета значений LacZ.  Чтобы использовать приложение, сначала Скачайте бесплатно программное обеспечение Java (как указано в Таблице материалов). Затем откройте приложение LacZ. Пластина макет, используемый с приложением должно быть идентично макет пластины, представлены на рисунке 1. Если некоторые примеры скважины не использовались, сохраняют поглощения чтений из пустой скважин как место Держатели в наборе поглощения, вставить в приложение LacZ.  Это сохраняет пространственное расположение пластины в приложение и гарантирует, что средства массовой информации контроль скважины в нужное место.  Кроме того приложение не будет выполняться, если есть пустые ячейки. Вставить в ОД405 чтения (для ONPG) или ОД574 чтений (для CPRG) всех скважин с помощью ввода команды с клавиатуры «control (ctrl) + v» или «command» + «v,» в зависимости от платформы компьютера используется. Введите количество время инкубации в часов для assay производить цвета (из шага 5.4; например, в 0.66667 ч 40 мин). Нажмите кнопку Далее. Вставьте в ОД610 чтений из шага 5.3. Нажмите кнопку Отправить. LacZ результаты будут отображаться и могут быть скопированы, нажав клавишу «control (ctrl) + c» или «команда + c,» зависящ на компьютерной платформе используется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Приложение 2. Параметры статистического программного обеспечения для расчета EEQs. EEQs может быть рассчитана с помощью одного из трех представленных вариантов.  Инструкции по использованию 1. JMP программного обеспечения или 2. Код R приводятся в приложении 2.  Код R также был преобразован в 3. формат приложения доступны на https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Приложение 3. Образцы, собранные с помощью дрожжей что Экспресс ERα и CPRG как субстрат. Измерения OD610 и OD574 для каждого из семи E2 стандартов, транспортных средств и средств массовой информации управления, и одного представителя PCP образца включены, наряду с расчитанным LacZ. LacZ значения стандартов были использованы для построения модели логистической регрессии 4 параметр стандартной кривой, как описано в шагах 7а & B выше. Интерполировать тройные оценки EEQs репрезентативной выборки в нг/мл в скважинах Гонав была использована модель. Эти значения затем были преобразованы в EEQs виде нг/г образца (шаг 8.1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Да это низкая стоимость метод используется для выявления эстрогенных лигандов в пробах окружающей среды, таких как вода, еда, растительных тканей или личной гигиены. Данные представлены здесь сравнить 2 эстрогеновых рецепторов (ERα и ERβ), 2 субстратов (ONPG и CPRG) и 2 сроков (2 d протокол без охлаждения) и 7 дневный протокол с охлаждением для измерения estrogenicity в продуктах личной внимательности через да assay. 7 d, охлажденных протокол, с помощью CPRG и выражая ERα или ERβ лучше дрожжи количественно EEQs, а также совместим с временные ограничения навязываемые по бакалавриату Лаборатория курсы, отвечающие только один раз / неделя в течение нескольких часов. В самом деле по сравнению с 2 d assay без охлаждения, охлажденных пробирного семь дней был связан с сокращением дисперсия через пластины реплицирует. Кроме того линейной части стандартной кривой слегка была расширена для данных, собранных с помощью холодильных assay. Линейная часть стандартной кривой определяет дальность обнаружения пробирного и является единственной частью стандартной кривой, который может использоваться для интерполяции образец EEQs.

В всех исклучая одной из испытанных образцов EEQs, измеряется с помощью CPRG были ниже, чем те, которые количественно с ONPG. С более высокий коэффициент вымирания и Нижняя Kм и VМаксCPRG десять раз чувствительнее, чем ONPG17. Таким образом CPRG может использоваться при более низких концентрациях и могут быть использованы для выявления нижнюю β-галактозидазы. По этим причинам CPRG предпочтительнее вообще ONPG18,19. Однако большую чувствительность субстрат не объяснить, с CPRG обнаружены более низкие значения EEQ. Более высокие значения EEQ, обнаружены с ONPG может быть вызвано матрицы интерференции с assay, как было отмечено другими авторами2,18. Желтые пигменты от личной гигиены продукта выдержки может надуть EEQ значения, обнаруженные с ONPG. Другие обойти эту проблему, включая контроль пигмента в их экспериментальный дизайн2, подход, который удваивает количество пластин в эксперименте. Когда матрица вмешательство может быть проблематичным, CPRG может быть предпочтительным субстрат для assay Да, хотя это более дорого и требует больше инкубации раз чем ONPG. Кроме того изменение цвета, вызванные расщепления субстрата, β-галактозидазы более драматичным с CPRG, что делает его легче для студентов, чтобы визуализировать результаты.

Миллер и др. (2010), который спроектирован дрожжей, используемые в настоящем Протоколе, отметил, что дрожжи, выражая ERβ были более чувствительны к 17β-эстрадиола чем дрожжей, выражая ERα, вывод подтверждается нашими данных1430 x. Помимо потенциальных нюансы в строительстве плазмида, Миллер и др. (2010) не может объяснить эти различия в чувствительности14. Одно различие между двумя плазмидные конструкции является, что выражение ERα регулируется галактозы, тогда как выражение ERβ регулируется глюкозы или галактозы. Дрожжей, используемых в assay да культивировали в СМИ глюкозы и только дано галактозы, когда они разводят в начале assay. Таким образом выражая ERβ дрожжи могут накапливаться выше номеров копии рецептор белков до начала анализа, тем самым наделения более высокой чувствительности к эстрогенных лигандами.

Более низкую чувствительность ERα-выражая дрожжи можно объяснить более высоким уровнем обнаружения estrogenicity в образцах, измеренного с ERα, по сравнению с ERβ. Чтобы увеличить вероятность того, что образец EEQs будет обнаружен, пользователи могут использовать различные экстракции растворителями и методы или добавить больших объемов выборки дрожжи. Если используются большие объемы выборки, концентрации Е2 стандартов следует скорректировать таким образом, что же объем образцов и стандартов могут быть использованы в assay. Одно ограничение добавления более образца является, что дрожжи могут терпеть только 6-10% этанола, с лучшей толерантности при температуре инкубации 30 — 35 ° C20. Для контроля за эффекты этанола на дрожжи, следователи должны добавить тройные «дрожжи только» скважин в пластины макет и подтвердить, что ОД610 этих скважин «дрожжи только» сопоставимы с ОД610 транспортного средства контроля скважин немедленно После добавления LacZ буфера. Кроме того могут быть добавлены образцы, растворяется в этиловом спирте сухой микрорезервуар пластины и этанола, испаряется покинуть, прежде чем добавляются дрожжи. Диметилсульфоксид (ДМСО) используется также как образец растворителя в да assays, но окончательные рабочие концентрации ДМСО с дрожжи должна быть ограничена 1%12.

Да assay является мощным скрининга для выявления estrogenicity в пробах окружающей среды. В частности да обнаруживает лиганды, которые связывают ядерной эстрогеновых рецепторов, которые взаимодействуют с элементами ответ эстроген прямого выражения гена14. Однако да также имеет важные ограничения. Да не обнаружить ЭЭС, которые работают через неядерные механизмы, такие как мембранных рецепторов эстрогена или механизмы, которые включают дополнительные элементы, такие как факторы транскрипции активатор протеин 1 (AP-1). Кроме того поскольку дрожжи не имеют той же метаболической мощности как mammalian клеток, да не может обнаружить лиганды, которые требуют активации метаболических быть эстрогенных.

Кроме того да assay нельзя легко различать эстрогенных и анти-эстрогенных лигандами в сложных проб. Вместо этого он измеряет чистой estrogenicity, который является сумма эффект эстрогенных и анти-эстрогенных лигандов. Для количественного определения концентрации антагонистов ER или оценить ингибиторная активность смесей, assay могут быть изменены путем инкубации дрожжей с стандартным агонистов (17β-эстрадиола) и широкий спектр испытаний образец концентрации12. Этот процесс определяет если антагонистов в пробах может снизить активность агонист индуцированной репортер и обеспечивает полезные экран для выявления присутствия ER антагонистов в образцах.

Протокола, представленные здесь могут разместиться различные типы образцов, хотя некоторые образцы могут потребовать изменения действия по подготовке добычи и образца. Например EEQs, широко различались реплицирует некоторых продуктов личной гигиены. Более переменных образцы, как правило, содержат капельки масла или в противном случае не были полностью однородной, указав, что более липофильных растворителя, например диэтиловом эфире будет полезным. Кроме того масла и воска в продуктах личной гигиены могут быть исключены путем извлечения образцов с 50% этанола вместо 100% этанола.50% этанола добыча будет также захватить больше воды растворимые эстрогенных лигандами (например, некоторые пигменты). Однако 50% этанола испаряется более медленно, чем 100% этанола и таким образом может продлить время экстракции. Кроме того некоторые образцы (например, мыло) были цитотоксических дрожжи, в результате измерения плотности сокращение клеток (610OD). Фокс и др. (2008) показывают, что такие образцы следует разбавлять и повторно, если плотность различия клетки превышает 30% по сравнению с транспортного средства контроля скважин12.

Если да assay используется для аналитических исследований, кривые разбавления образца бассейнов может испытываться заранее определить соответствующие объемы экстракт для добавления дрожжей на шаге 4.5. Кроме того, экстракты могут быть одновременно проверены на несколько томов (например, 5 мкл и 20 мкл экстракт добавляются дрожжи в шаге 4.5) или разведения, которые охватывают порядков (например, 0,2 мкл, 2 мкл и 20 мкл). «Соответствующие» тома экстракта являются те, которые определяют estrogenicity, сопоставляя значения LacZ вдоль линейной части калибровочной кривой. Оптимизация предотвращает проблемы, вызванные слишком много или слишком мало образец добавления дрожжей, например цитотоксичность, ложных негативов или estrogenicity, что превышает калибровочной кривой. Как упоминалось выше, объемы выборок и E2 стандартов должны корректироваться, когда различное количество лигандом используются таким образом, что дрожжи подвергаются последовательного объема и концентрации этанола или другого транспортного средства через пластину.

Несмотря на потенциал для ложных негативов да пробирного была обнаружена как инструмент тестирования уровня 3 для КМР, Schug et al. (2013), который разработал всеобъемлющий многоуровневого протокол для функционирования эндокринной системы (TiPED)21. Для undergraduate образования ценные для обучения концепции, связанные с эндокринной, культуры клеток, связывания рецептора, активность фермента, генной инженерии, статистики и экспериментальный дизайн assay. Студенты, которые используют assay также практиковать навыки фундаментальных и широко применимые Лаборатория как серийно, разведение стандартов; Извлечение образцов; принятия решения; строительство и интерполяции стандартных кривых; расчет концентрации; принятия решения; демонстрируя стерилизации; Культивирование клеток; Определение переменных и элементов управления; сбора, Организации и анализа данных; Построение и интерпретация графиков; и с использованием общих лабораторного оборудования, таких как micropipettors и спектрофотометров.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект финансировался начальное финансирование TME и Амр Луизиана Tech университета и университета Фурман, соответственно. Дополнительное финансирование было предоставлено 2015 года факультет улучшению Грант Амр и TME от связанные колледжи Юга, Луизиана EPSCoR фунт Грант TME от национального научного фонда и Луизиана Совет регентов и премию путешествия для TME от Университет стран Юга. Мы благодарим д-р Дэвид Ойбанкс (Furman) для помощи в целях статистического анализа и г-н Кристофер Мур за «дает нам руку» во время съемок.

Materials

Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-215-365 Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge Fisher Scientific (www.fishersci.com) 75-063-839 Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner Fisher Scientific (www.fishersci.com) 17-012-823 Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 50125590H Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader BioTek (www.biotek.com) EPOCH2 A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software BioTek (www.biotek.com) GEN5 Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05LREEFSA Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-681-15E Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.
P10 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144562G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144565G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) FBE1200300 Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl.
Repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164001G Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Sterile 15-ml conical tubes with caps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05-539-801
Glass scintillation vials Fisher Scientific (www.fishersci.com) 03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid  Cole-Parmer (www.coleparmer.com) EW-01728-81
100 ml glass beakers Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-539H Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 ml glass Erlenmeyer flasks Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB500250 Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film  VWR (www.vwr.com) 60941-086
Metal forceps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12-000-157 Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir Fisher Scientific (www.fishersci.com) 07-200-127
Filtration units (0.2 µm) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 09-761-52
Squirt bottle (for ethanol) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-897-10 Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles Fisher Scientific (www.fishersci.com) 06-414-1D Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 ml glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27F Any glass serological pipets will suffice.
1 ml glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27C Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-3810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-8810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-9810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164150G Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB0875712 Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm Fisher Scientific (www.fishersci.com) S37440
Name Company Catalog Number Comments
Yeast 
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) MYA-151 Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα Addgene (www.addgene.org) pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) 
Receptor/reporter plasmid for ERβ Addgene (www.addgene.org) pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) 
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Difco agar BD (www.bd.com) 214530
Dithiothreitol Sigma (www.sigmaaldrich.com) D0632 CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) 10884308001
Yeast nitrogen base Sigma (www.sigmaaldrich.com) Y0626
Glucose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G8270
Galactose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G5388
Adenine sulfate Sigma (www.sigmaaldrich.com) A9126
Uracil Sigma (www.sigmaaldrich.com) U0750
Leucine Sigma (www.sigmaaldrich.com) L8000
Histidine Sigma (www.sigmaaldrich.com) H8000
17 β-Estradiol  Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals  E8875-250 mg     0219456401 – 1 mg CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) 111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) Sigma (www.sigmaaldrich.com) S0876
Magnesium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) M8266
Potassium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) Sigma (www.sigmaaldrich.com) L5125
Sodium carbonate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S7795
Name Company Catalog Number Comments
Software
Excel spreadsheet software Microsoft  Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)  Oracle Corporation To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0 SAS Institute Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software R Foundation Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).
  2. Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).
  3. Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).
  4. Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).
  5. Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J., McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).
  6. Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).
  7. Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).
  8. Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).
  9. Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).
  10. De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).
  11. Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).
  12. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
  13. Miller, C. A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).
  14. Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).
  15. Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11 (6), (1991).
  16. Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).
  17. Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).
  18. Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).
  19. Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).

Tags

Yeast Estrogen ScreenPersonal Care ProductsEnvironmental EstrogensEndocrine DisruptionEcophysiologyIn VitroUndergraduate TeachingReagent PreparationSample ExtractionCentrifugationEthanol Evaporation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image