זיהוי ליגנדים אסטרוגניים במוצרי טיפוח אישי באמצעות של שמרים אסטרוגן מסך ממוטב עבור המעבדה הוראה לתואר ראשון

1. הכנת נוגדנים הכן גלוקוז, גלקטוז מדיה על ידי ערבוב 6.7 גרם שמרים חנקן הבסיס, 20 גרם דקסטרוז או גלקטוז, 20 מ ג אדנין סולפט (נוסף כמו 10 מ”ל של פתרון מניות מימית 200 מ”ג/100 מ”ל), 20 מ ג אורציל (נוסף כמו 10 מ”ל של פתרון מניות מימית 200 מ”ג/100 מ”ל) , לאוצין 60 מ ג (נוסף כמו 6 מ של פתרון מניות מימית 1 g/100 מ”ל), היסטידין 20 מ ג (נוסף כמו 2 מ של פתרון מניות מימית 1 g/100 מ”ל) מים יונים לאמצעי הסופי של Sterilize ל’ 1 על-ידי סינון (0.2 µm מסנן). ניתן לאחסן מדיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. להכין אסטרדיול (E2) סטנדרטים על ידי המסת E2 אבקת אתנול נטול מים, דילול ריכוזי עבודה המתאימה (227.5 nM & 9.75 ננומטר) ב- 50% אתנול.הערה: אם אסטרדיול נרכש כמו בקבוקון של 1 מ ג, להוסיף 1 מ”ל אתנול ישירות אל המבחנה לפזר אבקת אסטרדיול. זה מניב מניה 3.67 מ מ #1…  לדלל 10 μL של מניות #1 של אתנול 990 μL לעשות 1 מ”ל μM 36.71 מניות #2.  לאחר מכן, לדלל μL 10 מניות #2 באתנול 50% μL 990 לעשות 1 מ”ל של nM 367.13 מניות #3.  כדי להפוך את העבודה מניות, לדלל מניות μL 619.7 #3 באתנול 50% μL 380.3 כדי להפוך 1 מ”ל של 227.5 מלאי עבודה של nM, המשמש ליצירת עקומות סטנדרטי עם שמרים לבטא ERα.  לדלל מניות μL 26.56 #3 באתנול 50% μL 973.44 כדי להפוך 1 מ”ל של 9.75 מלאי עבודה של nM, המשמש ליצירת עקומות סטנדרטי עם שמרים לבטא ERβ. חותם סטנדרטים עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב-20 או-70 מעלות צלזיוס.התראה: E2 הוא מסרטן חשד, toxicant הרבייה. . זה מזיק אם נשאף, נבלע, או נספג דרך העור. E2 עלולה להזיק עם ההנקה עוברים וילדים. E2 רעיל מאוד חיים מימיים. משתמש הגנה אישית המתאימה (כפפות, fume הוד, מסכת אבק), להימנע מחשיפה במהלך ההריון וההנקה. להיפטר E2 כמו פסולת מסוכנת, אל תשחררי לסביבה. הכנת מאגר LacZ על ידי ערבוב 8.52 גרם נה2HPO4, g 5.52 NaH2PO4•H2O, מ ג 95.21 MgCl2, 745.5 מ”ג אשלגן כלורי, מלח נתרן 2 g N-lauroylsarcosine, ONPG (400 מ”ג) או CPRG (77.7 מ ג) במים יונים כדי מבחן סופי נפח של 1 ל חנות LacZ מאגר ב- 20 מ ל aliquots ב-20 ° C.הערה: aliquot 20 מ ל מספיקה לצלחת 96-ובכן אחד. הכן נתרן פחמתי באמצעות ערבוב 105.9 g סודיום קרבונט במים יונים לאמצעי הסופי של ל’ 1, בחנות RT. להכין dithiothreitol 1 מ’ (DTT) במים. הקפאת 25 aliquots µL של DTT ב-20 ° C.התראה: DTT הוא עור חריפה ו עין מגרה. השתמש ציוד למיגון אישי המתאים (כפפות, fume הוד, מסכת אבק) כדי להימנע העור, קשר עין, שאיפה, בליעה.הערה: כל aliquot מספיקה לצלחת 96-ובכן אחד. 2. הכנת מיצוי פקדים ודוגמאות בחר דוגמאות כדי לבחון.הערה: מאמר זה מציג נתונים על PCPs 15, לרבות סבון קרם שיער, שמפו, קרם הגנה, שפתון, קרן, קצף גילוח, לק, קרם. לשלב 1 g מדגם עם 10 מ”ל אתנול נטול מים צינור חרוטי 15 מ”ל. להכין את פקד החילוץ שלילי בהיקף של 11 מ”ל אתנול צינור חרוטי 15 מ”ל. להכין משכפל כנדרש.הערה: עבור עיצוב ניסיוני, הציג שלוש aliquots של כל 15 PCPs, פתרונות בקרה החילוץ triplicate היו מוכנים, מניב סכום כולל של 48 דוגמאות, שכל אחד מהם היה מנותח שהפקידים באמצעות הפרוטוקול בסעיף 4. צלחת יחיד יכול להכיל עד 23 דוגמיות ב- triplicates. אתנול נטול מים משמש בשלב זה מכיוון שהוא מתאדה בקלות. השתמש בפקדי החילוץ שלילי כדי לוודא כי האסטרוגן לא שטיפת לתוך דגימות מן הצינורות חרוט. Homogenize הרכבת התחתית תוכן למשך 30 דקות על-ידי שילוב של טלטול ידני vortexing או ע י ניעור צינורות על vortexer שפופרת מרובה. Centrifuge צינורות חרוט מהירות המותר המקסימלי ומפרידה דלי במשך 10 דקות Decant את תגובת שיקוע מהצינור כל דרך מסננת תא 40 µm לתוך צינור חרוטי 50 מ. תוכן ריק כל שפופרת 50 מ לתוך בקבוקון זכוכית נצנוץ. בקבוקונים. השאירו פתח בשכונה מאוורר לשבוע אחד לאפשר אתנול מתמוססות לחלוטין. לחלופין, יבש דגימות בשכונה מאוורר תחת חנקן או עם המאדה סובב. כדי למנוע השפלה של המרכיבים רגיש אור, להגן על דגימות ייבוש אור (למשל, בד אטום במקום מאוורר המנוע הדלת). לשקם דוגמאות 1.0 מ”ל של 50% אתנול וביו -מערבולת כדי homogenize. 3. culturing, Subculturing שמרים14 לשמור על תרביות שמרים פעילים (recombinant W303a זן של cerevisiae ס14) על ידי המקננת שמרים בתקשורת גלוקוז מחוטא-מסנן ב 30 º C. תת-תרבות שמרים שבועי בתקשורת גלוקוז מחוטא-מסנן טריים. שני לילות (כ ח 42) לפני הכנת לוחיות הרישוי. כן, תת-תרבות שמרים על-ידי הוספת 0.1 מ”ל של תרביות שמרים פעילים 10 מ”ל של גלוקוז מחוטא-מסנן התקשורת בטכניקה סטרילי.  דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שני לילות.  טלטול אינו נדרש, אם שמרים גדלים כמו תרבויות רדוד סטרילי 250 מ ל Erlenmeyer המבחנות.הערה: שמרים ניתן גם לאחסן על פלטות אגר בקירור למשך מספר חודשים. לאחסון לטווח ארוך (שנים), שילוב תרבויות O/N עם 15-50% גליצרול סטרילי, מערבולת ההקפאה ב-70 מעלות צלזיוס. כדי להכין גליצרול סטרילי, להשתמש מזרק להעביר גליצרול µL 300 לתוך cryovial החיטוי עם הפקק השתחררו. לאחר מכן להוסיף 1,200 µL O/N שמרים תרבות בטכניקה סטרילי. 4. הכנת לוחות כן (יום 1 וזמינותו) גביע סטרילי, בטכניקה סטרילי, לדלל שמרים משלב 3.2 צפיפות אופטית של ±0.005 0.065-610 nm (OD610) בתקשורת מחוטא-מסנן גלקטוז. לאשר צפיפות אופטית pipetting 120 μL של כל מדגם שמרים שהפקידים יחד עם גלקטוז triplicate ריקים לתוך צלחת ברור פוליסטירן (צלחת לא צריך להיות סטרילי).  השתמש ספקטרופוטומטרים צלחת כדי לוודא שיש התרבות שמרים מדולל OD נטו610 של קריאות OD610 לחסר ±0.005 0.065 גלקטוז החסר שמרים OD610 בהנחה כדי לקבוע OD נטו610 של השמרים. היכונו נפח סופי לפחות 30 מ”ל מדולל שמרים כל צלחת 96-ובכן.הערה: מסננים ספקטרופוטומטרים מדידת ספיגת בין 595, 610 nm יכול לשמש עבור יחידת מידה זו.משוער 1:6 יחס v: v של שמרים: מדיה בדרך כלל התשואות של יתר610 קרוב 0.065 אז להתחיל על-ידי הוספת שמרים 4.5 מ ל 30 מ ל מדיה, להוסיף עוד שמרים או מדיה לפי הצורך להשיג netOD610 בין 0.060 לבין 0.070. שימוש סטרילי טכניקה, להוסיף ההשעייה שמרים מדולל בארות סטרילי, פוליפרופילן, microplate 96-ובכן לפי התוכנית צלחת (איור 1). במהלך pipetting, שומרים על המקור הושעתה על ידי ברציפות מתערבל המכולה או ערבוב עם פיפטה שמרים. בשלב זה, מומלץ להשתמש pipettor חוזר עם טיפ מזרק סטרילי.הערה: לוחות פוליפרופילן סטריליים על ידי שני autoclaving לוחות מוערמים עטופה בנייר כסף.  הפלטה משמשת מכסה הצלחת מדגם יכול להיות שטף, בלוקי רי ו לעשות בה שימוש חוזר. הוסף מדיה גלקטוז מחוטא-מסנן µL 120 3 בארות נוספות (H10 – 12) לפי התוכנית צלחת (איור 1). הבארות הללו לשמש כפקדי מדיה עבור ספיגת שנתרם על-ידי התקשורת לבד. לבנות עיקול רגיל כל צלחת על ידי דילול באופן סדרתי triplicates של תקני עבודה E2 (227.5 nM עבור ERα, 9.75 nM עבור ERβ) בבארות המכיל את המתלים שמרים (A1 – G3) לפי התוכנית צלחת (איור 1).  להתחיל על-ידי הוספת 5 µL E2 סטנדרטים בארות A1 עד A3. לערבב תוכן microwell על ידי pipetting ולאחר מכן באופן סדרתי לדלל ההשעייה על-ידי הזזת 205 µL בארות A1 – 3 לתוך בארות B1 – 3. חזור על ערבוב והעברה של 205 µL דרך שורה ג’יהערה: לאחר השלמת דילול טורי, להתעלם μL 205 מבארות G1 – 3. בסוף שלב זה, כל בארות רגיל צריך להכיל 120 μL. דילול טורי תניב הריכוזים E2 הסופי המפורטים בטבלה1. עבור הצעדים דילול סדרתי, זה עוזר להשתמש pipettor רב-ערוצי עם טיפים סטרילי. להוסיף 5 µL של הרכב (50% אתנול) וולס בקרת רכב המכיל את המתלים שמרים (H1 – 3) על פי הפריסה צלחת (איור 1).הערה: הרכב שליטה הבארות משמשים לכמת רקע ספיגת המשויך תאי שמרים ומדיה. בנוסף, אפקטים קידום cytotoxicity או גדילה של הבדיקה דוגמאות יכול להתגלות על ידי השוואת הערכים610 OD של מבחן וולס עם אלה של הרכב שליטה בארות. להוסיף 5 triplicates µL של דגימות ופקדים החילוץ שלילי בארות המכיל את המתלים שמרים לפי התוכנית צלחת (איור 1).הערה: רשום אשר דוגמאות או מיצוי שלילי פקדים נוספים כדי מכל קידוח.  כדי לעקוב אחר אילו וולס יש דוגמאות אשר לא, להתחיל עם ארגז של טיפים, השתמש בעצות החל מהמיקומים בתיבה המיקומים של הבארות המתאימים בצלחת. לוח 96-ובכן אחד יכול להכיל עד 23 דגימות דולר. מערבבים את התוכן של המדגם, שליטה החילוץ, הרכב שליטה בארות על-ידי pipetting. התאם כרכים של בארות אלה כדי 120 µL על-ידי הסרת 205 µL מכל אחד כפי שמתואר במקרא איור1. חותם את plate(s) עם סרט סטרילי, דבק, נקבובי. תווית צלחות, תקופת דגירה של 17 h ב- 30 ° C. הצלחת אינו צריך להיות מזועזע במהלך הדגירה 5. עיבוד כן צלחות (יום 2 וזמינותו) לאחר הדגירה 17 h ב- 30 מעלות צלזיוס, להסיר את הלוחות של החממה. אם הצלחות יעובדו מיד, להמשיך לצעוד 5.1.1. אם הצלחות יעובדו במועד מאוחר יותר, להמשיך לצעוד 5.1.2. השתמש pipettor רב-ערוצי לערבב את התוכן של כל שורה של וולס, ולאחר מכן להעביר 50 µL של שמרים השעיה מכל קידוח כדי המתאימה גם של microplate ברור, פוליסטירן, 96-ובכן.הערה: לוחות פוליסטירן לא צריך להיות סטרילי אך עם מכסה. השתמש עצות pipet חדשות עבור כל שורה של בארות כדי להימנע מזהם-קרוס וולס, אף אם pipetting על פני triplicates עם פיפטה רב-ערוצי 8-עצה, טיפים רק צריך להשתנות בין קבוצות triplicate. תווית לצלחת חדשה. המשך לשלב 5.2. לאחסון צלחות לפני עיבוד, עוטף אותם בניילון נצמד. להכניס למקרר עטוף צלחות ב 4 ° C 6 ד לאחר מכן, להסיר את הלוחות מהמקרר לפתוח אותם, להעביר את התוכן של כל בארות על-ידי pipetting כמו שלב 5.1.1. המשך לשלב 5.2. הוסף 20 µL של 1 מ’ DTT 20 מיליליטר המופשרים, מאגר LacZ בטמפרטורת החדר עבור ריכוז סופי של 1 מ מ DTT. מאגר LacZ לערבב היטב. אם באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לוותר על לשמורה מגיב.התראה: ללבוש כפפות ולעבוד עם DTT בשכונה, אם אפשר משתמש או פיפטה רב-ערוצי או חוזרים pipettor, להוסיף µL 200 LacZ מאגר המכיל DTT, ONPG או CPRG כדי בארות כל צלחת פוליסטירן, ואני מיד למדוד ולהקליט OD610 של בארות כל שימוש ספקטרופוטומטרים צלחת. חזור על נדרש עבור לוחות נוספים.הערה: הקריאות610 OD משמשים במכנה של LacZ החישוב (שלב 6.1). מסיבה זו, לקבל מיד לאחר pipetting ולפני תאים ליישב המקראות או הן lysed על ידי LacZ מאגר. אם יתר הערכים610 עבור מדגם בארות באופן ניכר גבוהה או נמוכה יותר מאשר יתר הערכים610 עבור הרכב שליטה בארות, תמציות לדוגמה הם הצמיחה וקידום או ציטוטוקסיות כדי שמרים, בהתאמה. LacZ חישוב לתקן על הבדלים קטנים בצפיפויות התא על פני וולס, אבל אם ההבדלים יעלה על 30% בשני הכיוונים, ואז לדלל את הדגימה משוקם (מתוך שלב 2.6) באתנול 50% נוספים ובדוק את הדגימה על-ידי החזרת לשלב 3.2 12. מכסים צלחות עם מכסה. דגירה לוחות המכילים שמרים את ERα אקספרס14 ב 30 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות (עבור ONPG) או h 3 (עבור CPRG). דגירה לוחות המכילים שמרים את ERβ אקספרס14 ב 30 מעלות צלזיוס במשך 70 דקות (עבור ONPG) או 4 h (עבור CPRG).הערה: בעת עבודה עם CPRG, דגירה פעמים גמישים; המקננת עבור 2-4 h מניבה תוצאות מתאים עם שני רצפטורים, עם incubations יותר הגדלת הרגישות וזמינותו. לאחר המקננת צלחות, להשתמש פיפטה רב-ערוצי או pipettor חוזר כדי להוסיף 100 µL של נתרן פחמתי מכל קידוח. נתרן פחמתי מעלה את רמת החומציות, עוצר את התגובה β-galactosidase. למדוד ולהקליט את יתר405 (עבור ONPG) או OD574 (עבור CPRG) של בארות כל שימוש ספקטרופוטומטרים צלחת. 6.חישוב ערכים LacZ הערה: ערכי LacZ לכמת את מידת שינוי הצבע עבור כל דגימה ומציעים שיטה המנורמל של השוואת ערכים בין מבחני נפרד על ידי הנהלת חשבונות עבור מספר משתנים (למשלצפיפות אופטית שמרים, צפיפות אופטית מדיה, דגירה זמן אם הדבר שונה בין בארות באותה צלחת)12. לחשב אמצעים OD triplicate610 ערכים עבור מדיה (גלקטוז) שליטה וולס (H10-12), חישוב triplicate OD405 או OD574 ערכים עבור הרכב (50% אתנול) פקדים (H1-3). להשתמש באמצעים אלה, זמן הדגירה (t) בשעות לצלחת לשינוי צבע (שלב 5.5) לחישוב ערכי LacZ (תואם למידת שינוי צבע מכל קידוח) עבור כל תקן, דוגמת בארות באמצעות המשוואות הבאות: לחלופין, להשתמש היישום אוטומטית בנספח 1 לחישוב LacZ ערכים עבור תקנים ודוגמאות.הערה: הפריסה צלחת עם היישום להיות זהים על פריסת צלחת המוצג באיור1. אם לא היו מספר בארות לדוגמה, שומרים על ספיגת קריאות מן הבארות ריק כבעלי המקום ב- dataset ספיגת הדבקה ליישום LacZ נספח 1 .  זה שומר על הפריסה המרחבית של הצלחת ביישום ומבטיחה כי בארות בקרת מדיה הם במיקום הנדרש שלהם.  בנוסף, היישום לא תופעל אם קיימים תאים ריקים. לחשב אמצעי triplicate LacZ ערכים עבור כל רמת E2 וכל דגימה. הדו ח אומר LacZ ערכים כמו µL-1h-1. יומן-שינוי הריכוזים של כל E2 סטנדרטי ולהפיק מסמך גיליון אלקטרוני שעוצב כמו הקובץ template.csv (נספח 2). 7. אינטרפולציה מדגם אסטרדיול מקבילות (EEQs) באמצעות רגרסיה לוגיסטית 4-פרמטר הערה: EEQs מתייחסים ערכים LacZ לדוגמה (שינוי צבע) הערכים LacZ של העקומה סטנדרטיים שנוצרו באמצעות E2. EEQs אפוא לקבוע כמה דוגמאות נדרש להפיק את ההיענות שינוי צבע באותו ריכוז ידוע של E2. לחישוב EEQs עבור הבדיקה דוגמאות, תחילה להתוות העקומה סטנדרטי. מתאים רשע LacZ ערכים עבור תקנים E2 (ציר y) והמקביל טרנספורמציה-יומן E2 הריכוזים (ציר x) מודל רגרסיה לוגיסטית ארבע-פרמטר. להשתמש את המודל כדי לבצע אינטרפולציה EEQs עבור ערכים LacZ דגימה לבדיקה. לערוך חישובים רגרסיה לוגיסטית של EEQs באמצעות תוכנה סטטיסטית כפי שמתואר בספר נספח 2. 8. סטנדרטיזציה EEQs (ng/mL) למיסה מדגם פאנציקלידין להתייחס EEQs כמות הדגימה פאנציקלידין הוסיף אחד טוב בשלב 4.5, להכפיל הנפח הכולל ציפוי לתוך הבארות מדגם (325 µL) EEQ (ng/mL) ולאחר מכן לחלק על ידי כמות הדגימה שחולצו הוסיף את כל טוב (5 µL).הערה: ערכים אלה מייצגים EEQ לכל מ של דגימה שחולצו. אם הדגימות היו מוכנים באמצעות 1g של פאנציקלידין, ערכים אלה מייצגים גם EEQ לגרם של פאנציקלידין (ng/g). לידי ביטוי בדרך זו, EEQ ערכים (ng/g) ניתן להשוות על פני ערכים PCPs. EEQ (ng/g) שונים מוצרי טיפוח אישי שנבדקו במחקר זה מוצגות בטבלה מס ‘ 2, ואת נתוני דגימה שנאספו לאורך כל פרוטוקול כולו הכלולים נספח 3.