Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado

1. elaboración reactivos Preparar medios de glucosa y galactosa mediante la mezcla de 6,7 g levadura nitrógeno base, 20 g dextrosa o galactosa, 20 mg de sulfato de adenina (agregado como 10 mL de una solución stock acuosa de 200 mg/100 mL), uracil 20 mg (agregado como 10 mL de una solución stock acuosa de 200 mg/100 mL) , 60 mg leucina (agregado como 6 mL de una solución stock acuosa de 1 g/100 mL) e histidina 20 mg (agregado como 2 mL de una solución stock acuosa de 1 g/100 mL) en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. esterilizar por filtración (0,2 μm filtro). Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C durante varias semanas. Preparar el estradiol (E2) estándares de E2 en polvo disuelve en etanol anhidro y dilución de las concentraciones apropiadas de trabajo (227.5 nM & 9.75 nM) en etanol al 50%.Nota: Si estradiol se adquiere como un vial de 1 mg, agregar 1 mL de etanol directamente en el vial para disolver el polvo de estradiol. Esto produce una acción de 3,67 mM #1.  Diluir 10 μL del stock de #1 en 990 etanol μL para hacer 1 mL de caldo μM 36.71 #2.  Luego, diluir 10 μL del stock de #2 en 990 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de stock nM 367.13 #3.  Para realizar las acciones de trabajo, diluir 619.7 stock μL #3 de 380.3 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de 227,5 nM valores de trabajo permite crear curvas estándar con levadura expresión ERα.  Diluir 26.56 stock μL #3 de 973.44 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de 9.75 nM stock de trabajo utilizado para crear curvas estándar con levadura expresando ERβ. Sello de normas con parafilm y almacenar a -20 ó -70 º C.PRECAUCIÓN: E2 es un carcinógeno y tóxicos reproductivos. Es dañino si se inhala, se traga o absorbe por la piel. E2 puede causar daño a la lactancia de los niños y los fetos. E2 es muy tóxico para la vida acuática. Utilice protección personal adecuada (guantes, campana extractora, mascarilla) y evitar la exposición durante el embarazo y la lactancia. Deseche E2 como residuos peligrosos y no lo deje en el medio ambiente. Preparar LacZ buffer mezclando 8,52 g de Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4cuadrados2O, 95,21 mg MgCl2, mg 745,5 KCl, sal de sodio 2 g N-lauroylsarcosine y ONPG (400 mg) o CPRG (77,7 mg) en agua desionizada a una final volumen de 1 L. tienda LacZ tampón en alícuotas de 20 mL a-20 ° C.Nota: Una alícuota de 20 mL es suficiente para una placa de 96 pocillos. Preparación de carbonato de sodio mezclando 105,9 g de carbonato de sodio en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. tienda a TA. Preparar 1 M dithiothreitol (DTT) en agua. Congelar alícuotas de 25 μl de la TDT a-20 ° C.PRECAUCIÓN: TDT es un aguda de la piel y un irritante de los ojos. Utilizar equipos de protección individual adecuados (guantes, campana extractora, mascarilla) para evitar la piel y contacto con los ojos, inhalación e ingestión.Nota: Cada alícuota es suficiente para una placa de 96 pocillos. 2. preparación de muestras y controles de extracción Seleccionar muestras para probar.Nota: Este artículo presenta datos de para quince de PCP, incluyendo jabón, crema, champú, protector solar, bálsamo labial, Fundación, crema de afeitar, esmalte de uñas y loción. Combinar 1 g de muestra con 10 mL de etanol anhidro en un tubo cónico de 15 mL. Preparar un control negativo de extracción de 11 mL de etanol en un tubo cónico de 15 mL. Preparar repeticiones según sea necesario.Nota: Para el diseño experimental presentado, se prepararon tres alícuotas de 15 PCP y soluciones de control de la extracción por triplicado, dando un total de 48 muestras, cada una de ellas se analizó por triplicado utilizando el protocolo en la sección 4. Una sola placa puede alojar hasta 23 muestras en triplicado. Etanol anhidro se utiliza en este paso porque se evapora fácilmente. Utilice controles negativos de extracción para comprobar que los estrógenos no son lixiviación en las muestras de los tubos cónicos. Homogeneizar el contenido del tubo durante 30 minutos por una combinación de agitación manual y de Vortex o agitando los tubos en un tubo Vortex. Tubos de centrífuga cónicos a la máxima velocidad permitida en una cubo la centrifugadora durante 10 minutos decantar el sobrenadante de cada tubo a través de un tamiz de 40 μm células en un tubo cónico de 50 mL. Vacíe el contenido de cada tubo de 50 mL en un vial de centelleo de vidrio. Frascos de licencia abierta en una campana de ventilación para una semana permitir que el etanol se evapore completamente. Alternativamente, seque las muestras en una campana ventilada bajo nitrógeno o con un evaporador rotatorio. Para evitar la degradación de los componentes sensibles luz, proteger muestras de secado de la luz (por ejemplo, coloque el tejido opaco sobre puerta campana ventilada). Reconstituya las muestras en 1,0 mL de etanol al 50% y de vortex para homogeneizar. 3. cultivo y subcultivo levadura14 Mantener las culturas de levadura activa (recombinante W303a cepa de S. cerevisiae14) por incubación de levadura en medios de filtro esterilizado glucosa a 30 ° C. Subcultura levadura semanalmente en los medios de comunicación fresco esterilizado por filtro de glucosa. Dos noches (unos 42 h) antes de preparar las placas sí, subcultura de la levadura agregando 0,1 mL de cultivos de levadura activa a 10 mL de medio de filtro esterilizado de glucosa utilizando una técnica estéril.  Incubar a 30 ° C durante dos noches.  Agitación no es necesaria si la levadura se cultiva como cultivos superficiales en estéril de 250 mL Erlenmeyer frascos.Nota: La levadura puede también almacenarse en placas de agar refrigerado durante varios meses. Para almacenaje de más largo plazo (años), se combinan las culturas O/N con 15-50% de glicerol estéril, vortex y congelar a-70 ° C. Para preparar el glicerol estéril, utilizar una jeringa para transferir glicerol μl 300 un cryovial y un autoclave con la tapa que se afloja. Luego añadir 1.200 μL O/N levadura la cultura utilizando una técnica estéril. 4. preparar las placas sí (día 1 del ensayo) En un vaso estéril y utilizando una técnica estéril, diluir la levadura en el paso 3.2 a una densidad óptica de 0.065 ±0.005 610 nm (OD610) en medios de filtro esterilizado de la galactosa. Confirmar la densidad óptica por pipeteo 120 μL de cada muestra de levadura por triplicado junto con espacios en blanco de galactosa por triplicado en una placa de poliestireno claro (placa no necesita ser estéril).  Utilice un espectrofotómetro de placa para verificar que la cultura de la levadura diluida tiene una red de OD610 de 0,065 ±0.005 restar OD610 lecturas de espacios en blanco en la galactosa de lecturas de610 OD de levadura para determinar el neto del OD610 de la levadura. Preparar un volumen final de al menos 30 levadura mL diluido por cada placa de 96 pocillos.Nota: Pueden utilizarse filtros de espectrofotómetro mide la absorbancia entre 595 y 610 nm para esta medida.Un aproximado relación v: v de 1:6 de levadura: medios de comunicación produce típicamente un OD610 cerca de 0,065, así que comience agregando levadura de 4,5 mL a medios de 30 mL y agregar mas levadura o los medios de comunicación como adecuados lograr un netOD610 entre 0.060 y 0.070. Utilizando una técnica estéril, añadir esta suspensión de levadura diluidos a los pocillos de una estéril, polipropileno, microplacas de 96 pocillos según el diseño de la placa (figura 1). Durante el pipeteo, mantenga la fuente de levadura suspendida por continuamente girando el recipiente o mezclar con la pipeta. Para este paso, es útil usar una pipeta de repetición con la punta de una jeringa estéril.Nota: Las placas de polipropileno son esterilizadas por autoclave dos apiladas las placas envueltas en papel de aluminio.  La placa superior sirve como una tapa para la placa de la muestra y puede ser lavado, re-autoclave y reutilizado. Añadir 120 μl galactosa esterilizado por filtro de los medios de comunicación a 3 pozos adicionales (H10 – 12) según el diseño de la placa (figura 1). Estos pozos sirven como controles de medios para tener en cuenta la absorción por los medios de comunicación solo. Construir una curva estándar en cada placa por dilución en serie triplicados de las normas de trabajo de E2 (227.5 nM de ERα, 9.75 nM de ERβ) en los pozos que contiene la suspensión de levadura (A1 – G3) según el diseño de la placa (figura 1).  Comience por añadir 5 μl de los estándares de E2 en los pocillos A1 a A3. Mezclar el contenido del pocillo mediante pipeteo y luego diluir en serie esta suspensión moviendo 205 μl de pozos A1 – 3 en los pocillos B1 – 3. Repetir la mezcla y la transferencia de 205 μl a través fila G.Nota: Después de la dilución serial, deseche 205 μL de pozos G1 – 3. Al final de este paso, todos los pozos estándar deben contener 120 μL. La dilución seriada permite obtener las concentraciones finales de E2 enumeradas en la tabla 1. Para los pasos de dilución seriada, es útil usar una pipeta multicanal con puntas estériles. Añadir 5 μl de vehículo (etanol al 50%) a los pocillos de control del vehículo que contiene la suspensión de levadura (H1 – 3) según el diseño de la placa (figura 1).Nota: Pozos de control de vehículos se utilizan para cuantificar la absorbancia de fondo asociada a medios de comunicación y las células de levadura. Además, citotoxicidad o crecimiento promover efectos de prueba de las muestras pueden detectarse mediante la comparación de los valores de OD610 de prueba de pozos con los pocillos de control del vehículo. Añadir 5 triplicados μl de las muestras y los controles negativos de extracción para pozos que contiene la suspensión de levadura según el diseño de la placa (figura 1).Nota: Tome nota de que muestras o controles negativos de extracción se añaden a cada pocillo.  Seguimiento de que wells tienen muestras y que no, comenzar con una nueva caja de consejos y utilice sugerencias desde los mismos lugares en el cuadro que las ubicaciones de los pozos correspondientes en la placa. Una placa de 96 pocillos para alojar hasta 23 muestras por triplicado. Mezcle el contenido de la muestra, control de extracción, pozos de control de vehículos mediante pipeteo. Ajustar los volúmenes de estos pozos a 120 μl quitando 205 μl de cada uno como se describe en la leyenda de la figura 1. Selle la placa con una capa estéril, adhesiva y porosa. Etiqueta de las placas e incubar de 17 h a 30 ° C. La placa no necesita agitarse durante la incubación 5. proceso sí placas (día 2 del ensayo) Después de la 17 h de incubación a 30 ° C, quitar las placas de la incubadora. Si las placas se procesarán inmediatamente, proceda al paso 5.1.1. Si las placas se procesarán en una fecha posterior, proceda al paso 5.1.2. Utilice una pipeta multicanal para mezclar el contenido de cada fila de pozos y entonces transfiera 50 μl de suspensión de levadura de cada pozo el correspondiente pozo de una microplaca clara, poliestireno, 96-well.Nota: Las placas de poliestireno no necesita ser estéril pero deben tener una tapa. Use puntas de pipeta nueva para cada fila de pozos para evitar Cruz-contaminar pozos, aunque si pipeteo en triplicado con una pipeta multicanal de 8 puntas, puntas sólo necesitan cambiar entre sistemas por triplicado. Etiqueta de la nueva placa. Continúe con el paso 5.2. Para almacenar las placas antes de procesar, envuélvalos en papel plástico. Refrigere envueltas placas a 4 ° C para 6 d. después, sacar las placas de la nevera, les saque y transferir el contenido de todos los pozos mediante pipeteo como en el paso 5.1.1. Continúe con el paso 5.2. Añadir 20 μl de DTT de 1 M a 20 mL de tampón de LacZ temperatura descongelado, para una concentración final de 1 mM TDT. Buffer de mezcla LacZ bien. Si con una pipeta multicanal, dispensar en un reservorio de reactivo.PRECAUCIÓN: Use guantes y trabajar con TDT en una campana, si es posible Usando ya sea una pipeta multicanal o pipeta de repetición, añadir 200 μL de tampón de LacZ que contienen TDT y ONPG o CPRG en todos los pocillos de la placa de poliestireno e inmediatamente Mida y registre el OD610 de todos los pozos utilizando un espectrofotómetro de placa. Repita según sea necesario para las placas adicionales.Nota: Las lecturas de OD610 se utilizan en el denominador del cálculo del LacZ (paso 6.1). Por este motivo, obtener la lectura inmediatamente después de su uso y antes de colocar las células o son sometidas a lisis por buffer de LacZ. Si OD610 valores para pozos de muestra son notablemente superior o inferior de los valores de OD610 para pocillos de control del vehículo, los extractos de muestra son promover el crecimiento o citotóxico a levadura, respectivamente. El LacZ cálculo corregirá para pequeñas diferencias en las densidades de célula a través de pozos, pero si las diferencias superan el 30% en cualquier dirección, entonces diluir la muestra reconstituida (del paso 2.6) en etanol al 50% adicional y vuelva a probar la muestra volviendo al paso 3.2 12. Placas con una tapa. Incube las placas que contienen levadura que expresa ERα14 a 30 ° C durante 40 minutos (de ONPG) o 3 h (para CPRG). Incube las placas que contienen levadura que expresa ERβ14 a 30 ° C durante 70 min (ONPG) o 4 h (para CPRG).Nota: Cuando se trabaja con CPRG, tiempos de incubación son flexibles; Incubar durante 2-4 h produce resultados adecuados con los receptores, con incubaciones más aumentando la sensibilidad del ensayo. Después de incubar las placas, utilice una pipeta multicanal o pipeta de repetición para agregar 100 μl de carbonato de sodio a cada pocillo. Carbonato de sodio eleva el pH y detiene la reacción de la β-galactosidasa. Mida y registre el OD405 (de ONPG) o OD574 (para CPRG) de todos los pozos utilizando un espectrofotómetro de placa. 6.Calcular valores de LacZ Nota: Valores de LacZ cuantificar el grado de cambio de color para cada muestra y ofrecer un método normalizado de comparar valores entre ensayos separados por la contabilidad de varias variables (p. ej., densidad óptica levadura, densidad óptica media e incubación tiempo si Esto difiere entre pozos en la misma placa)12. Calcular medios triplicados OD610 valores de los medios de comunicación (galactosa) pocillos de control (H10-12) y calcular medios de triplicado OD405 o OD574 valores para el control del vehículo (etanol al 50%) (H1-3). Utilizar estos medios y el tiempo de incubación (t) en horas de la placa para cambiar color (paso 5.5) para calcular valores de LacZ (correspondiente al grado de cambio de color en cada pocillo) para todo el estándar y muestra los pozos utilizando las siguientes ecuaciones: Por otra parte, la aplicación automatizada en el Apéndice 1 para calcular valores de LacZ para estándares y muestras.Nota: El diseño de la placa con la aplicación debe ser idéntico en el diseño del plato presentado en la figura 1. Si algunos pozos de muestra no se utiliza, mantener lecturas de absorbancia de los pocillos vacíos como los titulares de lugar en el conjunto de datos de absorbancia se pega en la aplicación de LacZ Apéndice 1 .  Esto conserva la disposición espacial de la placa en la aplicación y asegura que pozos de control de los medios de comunicación están en la posición requerida.  Además, la aplicación no se ejecutará si hay celdas vacías. Calcular medios de valores de LacZ por triplicado para cada muestra y cada estándar E2. Informe valores LacZ como μl-1h-1. Transformación de registro de las concentraciones de cada E2 estándar y generar un documento de hoja de cálculo con formato del fichero de template.csv (Apéndice 2). 7. interpolar muestras equivalentes de Estradiol (EEQs) mediante regresión logística 4 parámetros Nota: EEQs se relacionan con valores de LacZ muestra (cambio de color) los valores de LacZ de la curva estándar con E2. EEQs así determinar cuánto muestra es necesaria para obtener la misma respuesta de cambio de color como una concentración conocida de E2. Para calcular el EEQs de las muestras de prueba, primero trazar la curva estándar. Ajuste valores LacZ E2 normas (eje y) y el registro-transformada E2 concentraciones correspondientes (eje x) a un modelo de regresión logística de cuatro parámetros. Usar el modelo para EEQs de interpolar para valores de LacZ de la muestra de prueba. Llevar a cabo cálculos de regresión logística de EEQs utilizando software estadístico, como se indica en el Apéndice 2. 8. normalización EEQs (ng/mL) a la masa de la muestra de PCP EEQs se relaciona con la cantidad de muestra de la PCP a cada bien en el paso 4.5, EEQ (ng/mL) se multiplican por el volumen total plateado en los pocillos de la muestra (325 μL) y entonces dividir por el volumen de muestra extraído agregó a cada pozo (5 μl).Nota: Estos valores representan EEQ por mL de muestra extraída. Si las muestras se prepararon con 1 g de PCP, estos valores representan también EEQ por gramo de PCP (ng/g). Expresado de esta manera, valores EEQ (ng/g) pueden ser comparados a través de diferentes valores de PCP. EEQ (ng/g) para los productos de cuidado personal probados en este estudio se muestran en la tabla 2, y muestra datos recogidos en todo el conjunto del protocolo están incluidos en Apéndice 3.