Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması
Summary
Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bu çalışmada, entegrasyonsuz bir yöntemle indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla kondrosit üretmek için tohum hücreleri olarak periferik kan hücreleri (PBC'ler) kullandık. Embriyodik vücut (EB) oluşumu ve fibroblastik hücre genişlemesini takiben, iPSC'ler, serumsuz ve xeno içermeyen koşullar altında 21 gün süreyle kondrojenik farklılaşma için indüklenir. Kondrosit indüksiyonundan sonra, hücrelerin fenotipleri morfolojik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal analizler ile kondrojenik farklılaşma belirteçlerinin kantitatif gerçek zamanlı PCR muayenesi ile değerlendirilir. Kondrojenik peletler pozitif alsi mavisi ve toluidin mavisi boyaması gösterir. Kolajen II ve X boyamasının immünohistokimyası da pozitiftir. Sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) içeriği ve kondrojenik farklılaşma belirteçleri COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 ve AGGRECAN , chondHiPSC'ler ve fibroblastik hücrelere kıyasla pıhtılaşmış peletler. Bu sonuçlar, PBC'lerin hastaya özgü ve maliyet-etkin olan kıkırdaklar onarımı için iPSC'ler üretmek üzere tohum hücreleri olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Kıkırdak dokusu kendi kendine onarım ve rejenerasyon için çok zayıf bir kapasiteye sahiptir. Çeşitli cerrahi müdahaleler ve biyolojik tedaviler, kıkırdağı ve eklem işlevini yerine getirmekte, tatmin edici sonuçlarla birlikte kullanılmamaktadır. Kök hücre teknolojisinin son zamanlardaki gelişimi tüm kıkırdak onarım alanını değiştirebilir 1 . Çeşitli kök hücreleri, tohum hücre olarak incelenmiştir, ancak red reaksiyonları 2 neden olmaksızın hastanın spesifik hücrelerin çok çeşitli sağlayabilir insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs), en çok umut verici bir seçim olarak görünmektedir. Dahası, yetişkin hücrelerin sınırlı proliferatif özelliklerini yenebilir ve kendi kendini yenileme ve pluripotent yeteneklerini sürdürebilirler. Dahası, gen hedefleme, belirli kondrosit tiplerini elde etmek için genotipi değiştirmek için kullanılabilir.
Yeniden programlama potansiyelleri de iyi çalışıldığından, fibroblastlar iPSC'ler üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.Bununla birlikte, hastalardan gelen acılı biyopsi ve fibroblastların in vitro genişlemesine duyulan ihtiyaç gibi, gen mutasyonları ile sonuçlanabilecek bazı sınırlamalar hala mevcut 3 . Son zamanlarda, PBC'lerin yeniden programlama 4 için avantajlı olduğu bulunmuştur; Dahası, bunlar sıklıkla kullanılmakta ve bol miktarda depolanmaktadır. Çalışma odağını cilden yeniden yönlendirebilirler. Bununla birlikte, en iyi bilgimize göre, kondrositlere ayrışmayı takiben PBC yeniden programlama hakkında birkaç rapor bulunmaktadır.
Mevcut çalışmada, iPSC'lere yeniden programlayarak ve daha sonra kondrosit oluşumunu taklit etmek için iPSC'leri bir pelet kültür sistemi aracılığıyla kondrojenik soyla ayırarak alternatif bir kaynak olarak PBC'leri kullanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, iPSC'ler yoluyla PBC'lerden kondrosit üretmek için bir protokol sağlıyoruz. PBC'ler klinik alanda daha yaygın ve yaygın olarak kullanıldığından yeniden programlama için potansiyel bir alternatif olarak sunulmaktadır. Bu çalışmada, epidermal vektörler (EV), Zhang ve ark. Tarafından belirlenen yöntemi takiben, PBC'leri iPSC'lere yeniden programlamak için kullanıldı . 11 . Bu entegrasyon içermeyen bir yaklaşım klinik alanda <sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Xiaobin Zhang'a plasmidinden dolayı teşekkür etmek istiyorlar. Deney sırasında tür yardımları için Shaorong Gao'ya ve Qianfei Wang'a da teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81101346, 81271963, 81100331), Pekin 215 yüksek düzey yetenek projesi (No.2014-3-025) ve Pekin Chao-Yang Hastane Fonu (Yoktur) tarafından desteklenmektedir. , CYXX-2017-01) ve Çin Bilimler Akademisi (YL) Gençlik İnovasyon Tanıtım Derneği bulunmaktadır.
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
