הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced
Summary
אנו מציגים פרוטוקול ליצירת השושלת chondrogenic מן הדם ההיקפי האנושי (PB) באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה, הכוללת גבריות הגוף (EB) היווצרות, הרחבת תאים fibroblastic, אינדוקציה chondrogenic.
Abstract
במחקר זה, השתמשנו בתאי דם היקפיים (PBCs) כתאי זרע כדי לייצר chondrocytes באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה. לאחר גדילה של הגוף (EB) והתפשטות תאים fibroblastic, iPSCs הם המושרה עבור בידול chondrogenic במשך 21 ימים תחת סרום ללא תנאים ללא xeno. לאחר אינדוקציה chondrocyte, פנוטיפים של התאים מוערכים על ידי ניתוח מורפולוגי, immunohistochemical, וביוכימי, כמו גם על ידי כמותי בזמן אמת PCR בדיקה של סמנים בידול chondrogenic. את chondrogenic pellets להראות חיובי alcian כחול כחול toluidine מכתים. אימונוהיסטוכימיה של קולגן II ו- X מכתים הוא גם חיובי. תכולת ה- glycosaminoglycan (sGAG) וה- chondrogenic differentiation markers, COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 ו- AGGRECAN מוגברות באופן משמעותי ב- chondכדורי rogenic לעומת hiPSCs ותאי fibroblastic. תוצאות אלו מראות כי PBCs ניתן להשתמש בתאי זרע כדי ליצור iPSCs עבור תיקון הסחוס, שהוא החולה ספציפי וחסכוני.
Introduction
רקמת הסחוס יש יכולת ירודה מאוד לתיקון עצמי התחדשות. התערבויות כירורגיות שונות וטיפולים ביולוגיים משמשים כדי לשחזר סחוס פונקציה משותפת, עם תוצאות לא מספקות. הפיתוח האחרון של טכנולוגיית תא גזע עשוי לשנות את השדה תיקון סחוס כולו 1 . תאי גזע שונים נחקרו כתאי זרע, אך תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) להיראות הבחירה המבטיחה ביותר, כפי שהם יכולים לספק סוגים רבים של תאים ספציפי חולה מבלי לגרום לתגובות דחיית 2. יתר על כן, הם יכולים להתגבר על הטבע השגשוג המוגבל של תאים בוגרים ולשמור על התחדשות עצמית ויכולות pluripotent שלהם. יתר על כן, מיקוד גנטי יכול לשמש כדי לשנות את הגנוטיפ כדי לקבל סוגים מסוימים של chondrocytes.
Fibroblasts כבר בשימוש נרחב כדי ליצור iPSCs כי הפוטנציאל שלהם תכנות מחדש יש גם נחקרו היטב.עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות שיש להתגבר, כגון ביופסיה כואבת מן המטופלים ואת הצורך הרחבה במבחנה של fibroblasts, אשר עלול לגרום מוטציות גנים 3 . לאחרונה, PBCs נמצאו להיות יתרון עבור תכנות מחדש 4 ; יתר על כן, הם היו בשימוש נפוץ מאוחסן בשפע. זה אפשרי כי הם עשויים להפנות את המחקר להתמקד מן העור. עם זאת, למיטב ידיעתנו, ישנם כמה דוחות על תכנות מחדש PBC ואחריו בידול לתוך chondrocytes.
במחקר הנוכחי, אנו משתמשים PBCs כמקור חלופי על ידי תכנות מחדש אותם לתוך iPSCs ולאחר מכן הבדל iPSCs לתוך השושלת chondrogenic באמצעות מערכת התרבות גלולה על מנת לחקות היווצרות chondrocyte.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי ליצור chondrocytes מ PBCs באמצעות iPSCs. מכיוון שתוכניות PBC נפוצות יותר ונמצאות בשימוש נרחב בתחום הקליני, הן מוצגות כחלופה פוטנציאלית לתכנות מחדש. במחקר זה, נוקבים וקטורים (EV) שימשו כדי לתכנת מחדש PBCs לתוך iPSCs, בעקבות השיטה שנקבעה על ידי ג 'אנג et al.</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לזיאובין ג'אנג על הפלסמיד שלו. אנו מודים גם שאורונג גאו ו Qianfei ואנג על עזרתם סוג במהלך הניסוי. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.81101346, 81271963, 81100331), פרויקט הכשרונות הגבוהים בבייג'ינג 215 (No.2014-3-025), ובית החולים צ'או-יאנג בבייג'ינג (לא . CYXX-2017-01), ואת הנוער החדשנות לקידום האגודה של האקדמיה הסינית למדעים (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
