تشوندروسيتيس التفريق من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة البشرية المستحثة من الدم
Summary
نحن نقدم بروتوكول لتوليد النسب غضروفية من الدم المحيطي البشري (ي) عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة (إيبسس) باستخدام طريقة خالية من التكامل، والتي تشمل تشكيل الجنين (إب)، توسيع الخلايا الليفية، وتحريض غضروفية.
Abstract
في هذه الدراسة، استخدمنا خلايا الدم المحيطي (بك) كخلايا أولية لإنتاج غضروفية عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة (إيبسس) المستحثة بطريقة خالية من التكامل. بعد تشكيل الجنين (إب) وتشكيل الخلايا الليفية الخلية، هي التي يسببها إيبسس لتمايز غضروفي لمدة 21 يوما تحت ظروف خالية من المصل وخالية من شينو. بعد تحريض غضروفية، يتم تقييم المظاهر من الخلايا من خلال التحولات المورفولوجية، المناعية، والكيمياء الحيوية، وكذلك من خلال الوقت الكمي في الوقت الحقيقي فحص ير من علامات التمايز غضروفي. الكريات تشوندروجيك تظهر الأزرق أسيان إيجابي والتلوين الأزرق تلطيخ. المناعية من الكولاجين الثاني و X تلطيخ هو أيضا إيجابية. محتوى غليكوسامينوغليكان كبريتات (سغاغ) و علامات التمايز غضروفي كولاجن 2 ( COL2 )، كولاجين 10 ( COL10 )، SOX9 ، أغريغكان هي أوبريغولاتد بشكل كبير في تشوندالكريات روجينيك مقارنة هبسس والخلايا الليفية. وتشير هذه النتائج إلى أن بك يمكن استخدامها كخلايا البذور لتوليد إيبسس لإصلاح الغضاريف، وهو المريض محددة وفعالة من حيث التكلفة.
Introduction
الأنسجة الغضروف لديه قدرة ضعيفة جدا لإصلاح الذاتي وتجديد. وتستخدم التدخلات الجراحية المختلفة والعلاجات البيولوجية لاستعادة الغضروف والوظيفة المشتركة، مع نتائج غير مرضية. التطور الأخير لتكنولوجيا الخلايا الجذعية قد تغير كامل مجال إصلاح الغضروف 1 . وقد تم دراسة الخلايا الجذعية المختلفة كخلايا البذور، ولكن الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) يبدو أن الخيار الواعد، لأنها يمكن أن توفر أنواع كثيرة من خلايا المريض محددة دون التسبب في ردود الفعل الرفض 2 . وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن التغلب على الطبيعة التكاثري محدود من خلايا الكبار والحفاظ على قدراتهم الذاتية التجديد والقدرات متعددة القدرات. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام استهداف الجينات لتغيير النمط الوراثي للحصول على أنواع محددة من غضروفية.
وقد استخدمت الخلايا الليفية على نطاق واسع لتوليد إيبسس لأن إمكانات إعادة البرمجة الخاصة بهم كما تم دراستها جيدا.ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود التي يجب التغلب عليها، مثل خزعة مؤلمة من المرضى والحاجة إلى التوسع في المختبر من الخلايا الليفية، والتي قد تؤدي إلى طفرات الجينات 3 . وفي الآونة الأخيرة، تبين أن لجان البرنامج والميزانية مفيدة لإعادة البرمجة 4 ؛ وعلاوة على ذلك، كانت تستخدم عادة وتخزينها بشكل واف. فمن الممكن أنها قد إعادة توجيه التركيز الدراسة من الجلد. ومع ذلك، على حد علمنا، وهناك عدد قليل من التقارير عن إعادة برمجة بك تليها التمايز إلى غضروفية.
في الدراسة الحالية، ونحن نستخدم بك كمصدر بديل عن طريق إعادة برمجة لهم في إيبسس ومن ثم التفريق إيبسس في النسب غضروفية من خلال نظام الاستزراع بيليه من أجل محاكاة تشكيل غضروفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتوليد غضروفية من بك عبر إيبسس. لأن بك هي أكثر شيوعا وتستخدم على نطاق واسع في المجال السريري، فهي تعرض كبديل محتمل لإعادة البرمجة. في هذه الدراسة، تم استخدام ناقلات عرضية (إيف) لإعادة برمجة بك في إيبسس، وفقا للطريقة التي وضعتها تشانغ وآخرون.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا زياوبين تشانغ على البلازميد. كما نشكر شاورونغ قاو وكيانفي وانغ على مساعدتهم الكريمة خلال التجربة. ويدعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (No.81101346، 81271963، 81100331)، ومشروع بكين 215 المواهب رفيعة المستوى (No.2014-3-025)، وصندوق بكين تشاو يانغ مستشفى (لا (سيكس-2017-01)، وجمعية تشجيع الابتكار الشبابية للأكاديمية الصينية للعلوم (يل).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
