Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.
Abstract
In dieser Studie verwendeten wir periphere Blutzellen (PBCs) als Samenzellen, um Chondrozyten über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in einer integrationsfreien Methode zu erzeugen. Nach der Embryoidkörperbildung (EB) und der fibroblastischen Zellexpansion werden die iPSCs für die chondrogene Differenzierung für 21 Tage unter serumfreien und xenofreien Bedingungen induziert. Nach der Chondrozyteninduktion werden die Phänotypen der Zellen durch morphologische, immunhistochemische und biochemische Analysen sowie durch die quantitative Echtzeit-PCR-Untersuchung von chondrogenen Differenzierungsmarkern ausgewertet. Die chondrogenen Pellets zeigen eine positive alcianblaue und toluidinblaue Färbung. Auch die Immunhistochemie der Kollagen II und X Färbung ist positiv. Der sulfatierte Glycosaminoglycan (sGAG) -Gehalt und die chondrogenen Differenzierungsmarker COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 und AGGRECAN sind in chond signifikant hochreguliertRogene Pellets im Vergleich zu hiPSCs und fibroblastischen Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PBCs als Samenzellen verwendet werden können, um iPSCs für die Knorpelreparatur zu erzeugen, die patientenspezifisch und kostengünstig ist.
Introduction
Knorpelgewebe hat eine sehr schlechte Fähigkeit zur Selbstreparatur und Regeneration. Verschiedene chirurgische Eingriffe und biologische Behandlungen werden verwendet, um Knorpel und Gelenkfunktion wiederherzustellen, mit unbefriedigenden Ergebnissen. Die jüngste Entwicklung der Stammzellentechnologie kann das gesamte Knorpelreparaturfeld verändern 1 . Verschiedene Stammzellen wurden als Samenzellen untersucht, aber menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) scheinen die vielversprechendste Wahl zu sein, da sie viele Arten von patientenspezifischen Zellen liefern können, ohne Ablehnungsreaktionen zu verursachen 2 . Darüber hinaus können sie die begrenzte proliferative Natur der erwachsenen Zellen überwinden und ihre Selbsterneuerung und pluripotenten Fähigkeiten beibehalten. Darüber hinaus kann Gen-Targeting verwendet werden, um den Genotyp zu ändern, um spezifische Arten von Chondrozyten zu erhalten.
Fibroblasten wurden weithin verwendet, um iPSCs zu erzeugen, weil ihre Umprogrammierungspotentiale auch gut untersucht wurden.Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die überwunden werden müssen, wie die schmerzhafte Biopsie von Patienten und die Notwendigkeit für die in vitro Expansion der Fibroblasten, die zu Genmutationen führen können 3 . Kürzlich wurden PBCs als vorteilhaft für die Umprogrammierung von 4 gefunden ; Darüber hinaus wurden sie häufig genutzt und reichlich gelagert. Es ist möglich, dass sie den Studienfokus von der Haut umleiten können. Allerdings gibt es nach unserem besten Wissen nur wenige Berichte über die PBC-Neuprogrammierung, gefolgt von der Differenzierung in Chondrozyten.
In der aktuellen Studie nutzen wir PBCs als alternative Quelle, indem wir sie in iPSCs umprogrammieren und dann die iPSCs in die chondrogene Linie durch ein Pelletkultursystem differenzieren, um die Chondrozytenbildung zu imitieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung von Chondrozyten aus PBCs über iPSCs zur Verfügung. Weil PBCs häufiger und weit verbreitet im klinischen Bereich sind, werden sie als eine mögliche Alternative zur Umprogrammierung dargestellt. In dieser Studie wurden episomale Vektoren (EV) verwendet, um PBCs in iPSCs zu programmieren, nachdem die Methode von Zhang et al. 11 Dieser integrationsfreie Ansatz beinhaltet nicht die Integration der virusassoziierten Genotoxizität, von der an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Xiaobin Zhang für sein Plasmid. Wir danken auch Shaorong Gao und Qianfei Wang für ihre freundliche Hilfe während des Experiments. Diese Studie wird von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.81101346, 81271963, 81100331), dem Peking 215 High-Level-Talent-Projekt (Nr. 2014-3-025) und dem Peking Chao-Yang Hospital Fund (Nr CYXX-2017-01) und die Jugend-Innovationsförderungsvereinigung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
