Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico
Summary
Apresentamos um protocolo para gerar uma linhagem condrogênica de sangue periférico humano (PB) através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um método livre de integração, que inclui a formação de corpo embrionóide (EB), expansão de células fibroblásticas e indução condrogênica.
Abstract
Neste estudo, utilizamos células de sangue periférico (PBCs) como células de sementes para produzir condrócitos através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) em um método livre de integração. Após a formação do corpo embrionóide (EB) e a expansão das células fibroblásticas, os iPSCs são induzidos para a diferenciação condrogênica durante 21 dias sob condições isentas de soro e sem xeno. Após a indução de condrócitos, os fenótipos das células são avaliados por análises morfológicas, imuno-histoquímicas e bioquímicas, bem como pelo exame quantitativo em PCR em tempo real de marcadores de diferenciação condrogênica. Os grânulos condrogénicos mostram coloração azul alcian e azul de toluidina positiva. A imuno-histoquímica da coloração com colágeno II e X também é positiva. O teor de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) e os marcadores de diferenciação condrogénica COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 e AGGRECAN são significativamente regulados positivamenteGrânulos rogênicos em comparação com HiPSCs e células fibroblásticas. Esses resultados sugerem que os PBCs podem ser usados como células de sementes para gerar iPSCs para o reparo da cartilagem, que é específico do paciente e econômico.
Introduction
O tecido da cartilagem tem uma capacidade muito fraca de auto-reparação e regeneração. Várias intervenções cirúrgicas e tratamentos biológicos são usados para restaurar a função da cartilagem e articulação, com resultados insatisfatórios. O desenvolvimento recente da tecnologia de células-tronco pode mudar todo o campo de reparo de cartilagem 1 . Várias células-tronco foram estudadas como células de sementes, mas as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) parecem ser a escolha mais promissora, pois podem fornecer muitos tipos de células específicas do paciente sem causar reações de rejeição 2 . Além disso, eles podem superar a natureza proliferativa limitada das células adultas e manter suas habilidades auto-renováveis e pluripotentes. Além disso, a segmentação por genes pode ser usada para mudar o genótipo para obter tipos específicos de condrócitos.
Os fibroblastos têm sido amplamente utilizados para gerar iPSCs porque seus potenciais de reprogramação também foram bem estudados.No entanto, ainda existem algumas limitações que devem ser superadas, como a biópsia dolorosa dos pacientes e a necessidade de expansão in vitro dos fibroblastos, o que pode resultar em mutações genéticas 3 . Recentemente, os PBCs foram considerados vantajosos para a reprogramação 4 ; Além disso, eles eram comumente utilizados e armazenados abundantemente. É possível que eles possam redirecionar o foco do estudo da pele. No entanto, para o melhor de nosso conhecimento, há poucos relatórios sobre a reprogramação PBC, seguido de diferenciação em condrócitos.
No presente estudo, utilizamos PBCs como uma fonte alternativa, reprogramando-os para iPSCs e depois diferenciando os iPSCs na linhagem condrogênica através de um sistema de cultura de pelota para imitar a formação de condrócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo para gerar condrócitos de PBCs via iPSCs. Como os PBCs são mais comuns e amplamente utilizados no campo clínico, eles são apresentados como uma alternativa potencial para a reprogramação. Neste estudo, foram utilizados vetores episásicos (EV) para reprogramar PBCs em iPSCs, seguindo o método estabelecido por Zhang et al. 11 . Esta abordagem sem integração não envolve a integração da genotoxicidade associada ao vírus, que se acredita ter um efei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer Xiaobin Zhang pelo seu plasmídeo. Também agradecemos Shaorong Gao e Qianfei Wang por sua amável ajuda durante o experimento. Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.81101346, 81271963, 81100331), o projeto de talento de alto nível de Pequim 215 (No.2014-3-025) e o Fundo Hospitalar Beijing Chao-Yang (Não . CYXX-2017-01) e a Associação de Promoção da Inovação Juvenil da Academia Chinesa de Ciências (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
