Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang
Summary
Nous présentons un protocole pour générer une lignée chondrogénique à partir de sang périphérique humain (PB) via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en utilisant une méthode sans intégration, qui comprend la formation de corps embryoïde (EB), l'expansion des cellules fibroblastiques et l'induction chondrogénique.
Abstract
Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules sanguines périphériques (PBC) comme cellules de semences pour produire des chondrocytes via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une méthode sans intégration. Après la formation de corps embryoïdaux (EB) et l'expansion des cellules fibroblastiques, les iPSC sont induits pour la différenciation chondrogénique pendant 21 jours dans des conditions exemptes de sérum et exemptes de xénon. Après l'induction des chondrocytes, les phénotypes des cellules sont évalués par des analyses morphologiques, immunohistochimiques et biochimiques, ainsi que par l'examen quantitatif en PCR en temps réel des marqueurs de différenciation chondrogénique. Les granulés chondrogénés présentent une coloration au bleu alcien positive et au bleu de toluidine. L'immunohistochimie de la coloration au collagène II et X est également positive. La teneur en glycosaminoglycanes sulfatés (sGAG) et les marqueurs de différenciation chondrogénique COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 et AGGRECAN sont significativement régulés à la hausseGranulés rogéniques par rapport aux hiPSC et aux cellules fibroblastiques. Ces résultats suggèrent que les PBC peuvent être utilisés comme cellules de graines pour générer des iPSC pour la réparation du cartilage, ce qui est spécifique au patient et rentable.
Introduction
Le tissu cartilagineux a une très faible capacité d'auto-réparation et de régénération. Diverses interventions chirurgicales et traitements biologiques sont utilisés pour restaurer le cartilage et la fonction articulaire, avec des résultats insatisfaisants. Le développement récent de la technologie des cellules souches peut changer l'ensemble du champ de réparation du cartilage 1 . Diverses cellules souches ont été étudiées comme cellules de semences, mais les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) semblent être le choix le plus prometteur, car elles peuvent fournir de nombreux types de cellules spécifiques du patient sans provoquer de réactions de rejet 2 . En outre, ils peuvent surmonter la nature proliférante limitée des cellules adultes et maintenir leur auto-renouvellement et leurs capacités pluripotentes. En outre, le ciblage des gènes peut être utilisé pour changer le génotype pour obtenir des types spécifiques de chondrocytes.
Les fibroblastes ont été largement utilisés pour générer des iPSC car leurs potentiels de reprogrammation ont également été bien étudiés.Cependant, il reste encore des limites qui doivent être surmontées, telles que la biopsie douloureuse des patients et la nécessité d' une expansion in vitro des fibroblastes, ce qui peut entraîner des mutations génétiques 3 . Récemment, les PBC ont été jugés avantageux pour la reprogrammation 4 ; De plus, ils étaient couramment utilisés et stockés abondamment. Il est possible qu'ils puissent réorienter l'étude de la peau. Cependant, selon le meilleur de notre connaissance, il existe peu de rapports sur la reprogrammation du PBC suivi d'une différenciation en chondrocytes.
Dans l'étude actuelle, nous utilisons les PBC comme source alternative en les reprogrammes dans les iPSC, puis en différenciant les iPSC dans la lignée chondrogénique à travers un système de culture de pastilles afin d'imiter la formation de chondrocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous fournissons un protocole pour générer des chondrocytes de PBC via iPSC. Étant donné que les PBC sont plus fréquents et largement utilisés dans le domaine clinique, ils sont présentés comme une alternative potentielle pour la reprogrammation. Dans cette étude, des vecteurs épisomaux (EV) ont été utilisés pour reprogrammer les PBC dans les iPSC, suivant la méthode établie par Zhang et al. 11 . Cette approche sans intégration n'implique pas l'intégration d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Xiaobin Zhang pour son plasmide. Nous remercions également Shaorong Gao et Qianfei Wang pour leur aide aimable pendant l'expérience. Cette étude est soutenue par la National Natural Science Foundation of China (No.81101346, 81271963, 81100331), le projet de talent de haut niveau de Beijing 215 (n ° 2014-3-025) et le fonds de l'hôpital Chao-Yang de Beijing (non . CYXX-2017-01) et l'Association pour la promotion de l'innovation des jeunes de l'Académie chinoise des sciences (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
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