Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen
Summary
Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.
Abstract
In deze studie hebben we perifere bloedcellen (PBC's) als zaadcellen gebruikt om chondrocyten te produceren via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in een integratievrije methode. Na de vorming van embryoïde lichaam (EB) en fibroblastische celuitbreiding worden de iPSC's geïnduceerd voor chondrogeen differentiatie gedurende 21 dagen onder serumvrije en xeno-vrije condities. Na chondrocytische inductie worden de fenotypes van de cellen geëvalueerd door morfologische, immunohistochemische en biochemische analyses, evenals door het kwantitatieve real-time PCR onderzoek van chondrogeen differentiatie markers. De chondrogeenpellets tonen positieve alcianblauw en toluidine blauwkleuring. De immunohistochemie van collageen II en X-kleuring is ook positief. Het gesulfateerde glycosaminoglycan (sGAG) gehalte en de chondrogeen differentiatie merkers COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 en AGGRECAN worden significant in de chronisch gereguleerdRogenic pellets vergeleken met hiPSCs en fibroblastische cellen. Deze resultaten suggereren dat PBC's kunnen worden gebruikt als zaadcellen om iPSC's te genereren voor kraakbeenherstel, dat is patiëntspecifiek en kosteneffectief.
Introduction
Kraakbeenweefsel heeft een zeer slechte capaciteit voor zelfherstel en regeneratie. Diverse chirurgische interventies en biologische behandelingen worden gebruikt om kraakbeen- en gewrichtsfunctie te herstellen, met onbevredigende resultaten. De recente ontwikkeling van stamceltechnologie kan het hele kraakbeenherstelveld 1 veranderen . Verschillende stamcellen zijn als zaadcellen bestudeerd, maar door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) lijken de meest veelbelovende keuzes te zijn, omdat ze vele soorten patiëntenpecifieke cellen kunnen leveren zonder afwijzingsreacties te veroorzaken 2 . Bovendien kunnen ze de beperkte proliferatieve aard van volwassen cellen overwinnen en hun zelfvernieuwende en pluripotente vaardigheden handhaven. Bovendien kan gen targeting gebruikt worden om het genotype te veranderen om specifieke soorten chondrocyten te verkrijgen.
Fibroblasten zijn veel gebruikt om iPSCs te genereren, omdat hun herprogrammeringspotenties ook goed bestudeerd zijn.Er zijn echter nog enkele beperkingen die moeten worden overwonnen, zoals de pijnlijke biopsie van patiënten en de noodzaak voor de in vitro- uitbreiding van de fibroblasten, die kan leiden tot genmutaties 3 . Onlangs bleken PBC's voordelig te zijn voor herprogrammering 4 ; Bovendien werden ze veelal gebruikt en overvloedig opgeslagen. Het is mogelijk dat ze de studiefocus van de huid kunnen doorsturen. Naar ons beste weten, zijn er maar weinig rapporten over PBC-herprogrammering gevolgd door differentiatie in chondrocyten.
In de huidige studie gebruiken we PBC's als een alternatieve bron door ze in iPSCs te programmeren en vervolgens de iPSC's te differentiëren in de chondrogene lijn door middel van een pelletcultuur systeem om chondrocytevorming na te bootsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier leveren we een protocol om chondrocyten van PBC's te genereren via iPSCs. Omdat PBC's meer voorkomend zijn en veel gebruikt worden op het klinisch gebied, worden ze gepresenteerd als een mogelijk alternatief voor herprogrammering. In deze studie werden episomale vectoren (EV) gebruikt om PBC's in iPSC's te herprogrammeren, volgens de methode die door Zhang et al werd vastgesteld. 11 . Deze integratievrije aanpak houdt in dat er geen virusgeassocieerde genotoxiciteit …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Xiaobin Zhang bedanken voor zijn plasmide. We bedanken ook Shaorong Gao en Qianfei Wang voor hun vriendelijke hulp tijdens het experiment. Deze studie wordt ondersteund door de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (nr.81101346, 81271963, 81100331), het Beijing 215 hoogwaardige talentproject (nr.2014-3-025) en het Beijing Chao-Yang Hospital Fund (nr. . CYXX-2017-01) en de Youth Innovation Promotion Association van de Chinese Academie voor Wetenschappen (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
