IPSC व्युत्पन्न मानव मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी जल्दी neurodevelopmental विकार मॉडल
Summary
Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
Abstract
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
Introduction
इस तरह के microcephaly के रूप में मानव neurodevelopmental विकार,, केवल खराब तथ्य यह है कि मानव मस्तिष्क एक विस्तारित cortical सतह, गैर मानव पशु से भिन्न एक अनूठी विशेषता है की वजह से पशु मॉडल में अध्ययन किया जा सकता।
इस पहलू मानव मस्तिष्क के विकास एक जटिल प्रक्रिया है कि पर्याप्त एक 2D में अध्ययन किया जा सकता है, इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली में बनाता है। उभरते 3 डी कल्चर तकनीक प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) से ऊतक की तरह organoids की पीढ़ी अनुमति देते हैं। एक 3 डी निलंबन संस्कृति में स्टेम सेल की इन विट्रो भेदभाव एक संगठित, स्तरीकृत ऊतक 1, 2, 3 को जन्म दे रही है, एक समय पर और क्षेत्र विशेष ढंग से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के गठन की अनुमति देता है। प्रयोगशालाओं कि 3 डी संस्कृति प्रौद्योगिकियों का बीड़ा उठाया है और अंग गठन की जटिलता demystified, स्टेम सेल से शुरू करने के लिए धन्यवाद,हम मानव मस्तिष्क के विकास के प्रारंभिक घटनाओं को चित्रित करने और इन विट्रो 1, 2, 3 में microcephaly मॉडल करने के लिए मस्तिष्क organoids पैदा करने में एक मजबूत पद्धति विकसित की। यह हम अनुकूलित कि लैंकेस्टर एट अल द्वारा विकसित मूल विधि से उल्लेखनीय है। मस्तिष्क organoids 1 उत्पन्न करने के लिए। इस विधि हमारे प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार संशोधित किया गया था।
गेब्रियल एट अल से एक अध्ययन का उद्देश्य। मस्तिष्क के विकास के दौरान तंत्रिका स्टेम कोशिका रखरखाव के सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण किया गया। ऐसा करने के लिए, एक यंत्रवत अध्ययन 3 डी मस्तिष्क organoids एक microcephaly रोगी 4 से व्युत्पन्न में तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) का विश्लेषण करके किया गया था। इस मरीज CPAP, एक संरक्षित centrosomal प्रोटीन सेंट्रोसोम जीवजनन 5 के लिए आवश्यक में एक उत्परिवर्तन ले गए। एक व्यापक रूप से स्वीकार हाइपोथीसिस कि microcephaly एनपीसी पूल की कमी का परिणाम है, और इस या तो कोशिका मृत्यु के लिए या समय से पहले भेदभाव 1, 6, 7, 8, 9 की वजह से हो सकता है।
Microcephaly मस्तिष्क organoids की वेंट्रिकुलर क्षेत्र (VZs) का विश्लेषण करके, यह दिखाया गया था कि NPCs के एक महत्वपूर्ण संख्या विषम कोशिका विभाजन से गुजरना, मस्तिष्क organoids एक स्वस्थ दाता 4 से व्युत्पन्न के विपरीत है। Microcephalic मस्तिष्क organoids के व्यापक सूक्ष्म और जैव रासायनिक विश्लेषण के समय पर सिलिया disassembly 4 में CPAP के लिए एक अप्रत्याशित भूमिका का पता चला। विशेष रूप से, उत्परिवर्तित CPAP मंद पपनी disassembly और देरी कोशिका चक्र पुनः प्रवेश साथ जुड़ा हुआ है, NPCs 4 के समय से पहले भेदभाव के लिए अग्रणी। इन परिणामों microcephaly और वें में सिलिया के लिए एक भूमिका का सुझावन्यूरोजेनेसिस और मस्तिष्क के आकार नियंत्रण 10 के दौरान eir भागीदारी।
इस प्रोटोकॉल के पहले भाग समरूप मस्तिष्क organoids उत्पन्न करने के लिए तीन चरणों की विधि का वर्णन है। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, मूल लैंकेस्टर प्रोटोकॉल अनुकूलित और हमारे उद्देश्य 1 सूट करने के लिए संशोधित किया गया था। सबसे पहले, मानव IPSCs Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) मैट्रिक्स पर एक परिभाषित फीडर मुक्त हालत में सुसंस्कृत हैं। यह कदम फीडर पर निर्भर स्टेम कोशिका संवर्धन के रूपांतरों बचा जाता है। इस प्रोटोकॉल में, तंत्रिका भेदभाव के शामिल होने तंत्रिका उपकला IPSCs से सीधे शुरू होता है के रूप में। embryoid शरीर (ईबी) गठन के कदम, एक और अधिक नियंत्रित और निर्देशित ढंग से तंत्रिका भेदभाव आय को छोड़ने पर। यह दृष्टिकोण अन्य जनन कोशिका परतों, इस तरह के मेसोडर्म और अन्तः के रूप में की सहज और अनिर्दिष्ट गठन सीमित करता है। इस प्रोटोकॉल को लागू करके, तंत्रिका rosettes युक्त neurospheres एह के लिए 5 दिन पर काटा जा सकता हैएस मैट्रिक्स एम्बेडिंग और स्थिर निलंबन संस्कृति। organoid हमारे प्रोटोकॉल के तीसरे चरण के लिए इस्तेमाल किया मध्यम dorsomorphin और SB431542 के साथ पूरक है। Dorsomorphin हड्डी morphogenic प्रोटीन (बीएमपी) के एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला है, और SB431542 TGFβ / activin / नोडल संकेतन मार्ग को रोकता है। इन कारकों का संयोजन तंत्रिका भेदभाव और अधिक कुशलता से की तुलना में अकेले 11, 12, 13, 14 रेटिनोइक एसिड को बढ़ावा देने के कर सकते हैं।
कुल मिलाकर, इन संशोधनों organoids भर में कम से कम बदलाव के साथ, मस्तिष्क organoids की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी सक्षम करें। महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि मजबूती के साथ रोगी IPSCs, जो जीन है कि तारक काय और सेल चक्र की गतिशीलता को प्रभावित में परिवर्तन ले जाने से microcephalic मस्तिष्क organoids उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया था।
इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग br तैयार करने के लिए निर्देश देता हैऐन विश्लेषण और microcephaly में सेलुलर दोषों की व्याख्या के लिए organoids। यह निर्धारण, cryosectioning, immunofluorescent धुंधला, और कोंफोकल सूक्ष्म विश्लेषण भी शामिल है। यह प्रोटोकॉल अपेक्षित परिणाम का विस्तृत विवरण के साथ और व्याख्या के लिए मार्गदर्शन के साथ पाठक प्रदान करेगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
MCPH एक जटिल मानव neurodevelopmental विकार है कि विवो में या साधारण मानव सेल संस्कृति इन विट्रो में दृष्टिकोण में पशु मॉडल में संक्षेप में दोहराया नहीं किया जा सकता है। MCPH के नैदानिक अभिव्यक्ति है, पहली तिमा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम फ़्रिट्ज़ थिसन फाउंडेशन (Az.10.14.2.152) द्वारा समर्थित किया गया। हम ऊतक एम्बेडिंग सुविधा और CMMC की माइक्रोस्कोप कोर सुविधा के आभारी हैं। हम चर्चा और सेंट्रोसोम और cytoskeleton जीवविज्ञान के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों द्वारा प्रदान की तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम पांडुलिपि proofreading के लिए ली मिंग Gooi धन्यवाद।
Materials
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
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