Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em> İn Vitro</em> sidualizasyonu

AlexaFluor Bu çalışma için tüm hayvan deneyleri KU Leuven (Belçika) (/ 2013 Proje P174) etik inceleme komitesi tarafından kabul edildi. Fareler gıda pelet ad libitum erişimine sahip, standart koşullar altında muhafaza ve musluk suyu ve kontrollü koşullar (23 ± 1.5 ° C, bağıl nem% 40 – 60, 12/12 aydınlık / karanlık döngüsü) altında tutuldu. 1. Fare Piyasada mevcut fare suşu (- 12 haftalık, yani C57BL / 6 kadın 8) kullanın. Tipik haliyle, 4-5 farenin başka deneyler için hücreler uygun miktarda ürün elde edilir. için 17β-estradiyol, 100 uL (E2) çözeltisi (100 ng / 100 ul) ile deri altından sağlam fareler enjekte 3 ardışık D hayvanların estrojen döngüsü faz standartlaştırmak ve endometriyal proliferasyonu oluşumunu sağlamak üzere izolasyon öncesinde hücreler. protokolü başlamadan önce farelerin döngüsü aşamasını kontrol etmek için ihtiyaç önlenebilir be olduğunu3 d 'östradiol tedavisinin neden olur. 2. hazırlıklar 100 ng / yerfıstığı yağı içinde 100 uL, E2'nin bir solüsyonun hazırlanması. Beş fareye (1.2 de tarif edildiği gibi) ve enjeksiyonlar için 1.5 ml bir miktarda gereklidir. 1 mg / mL'lik bir stok çözeltisi için 1 ml etanol içinde 1 mg E2 eritin. Bu stok solüsyonu 1 seyreltilir: 1.000 yerfıstığı yağı. 500 ml 1 x 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile tamamlanmış Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) (daha fazla HBSS + olarak anılacaktır) sağlayın. Kültür Mesc filtre Fare Endometriyal stromal hücre 500 ml yapmak (MESC) ortamı: fenol kırmızısı, L-glutamin ve 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik Dulbecco'nun Modifiye edilmiş Eagle ortamı / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) asit, N – (2-Hidroksietil) piperazin-N '- (2-etansülfonik asit) (HEPES),% 10 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B, 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden (further) MESC ortam olarak adlandırılır. desidualizasyon süresince kültür Mesc filtre% 2 MESC ortamının 500 ml yapmak: fenol kırmızısı, L-glutamin ve% 2 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B ihtiva eden HEPES, 100 ug / ml gentamisin ile DMEM / F12. süzüldü Fare Endometriyal Epitel Hücre 500 mL hazırlama (MEEC) ortamı:% 10 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B, 100 ug / ml gentamisin, 25% MCDB-105 aracı ve 5 mg / ml insülin içeren DMEM (daha fazla ifade ) MEEC ortamı olarak. MESC kültürü için Poli-L-lisin (PLL) kaplanmış lamelleri hazırlayın. damıtılmış su, 250 mL PLL 25 mg eritin. 0.22 mikron filtre kullanılarak çözüm Filtre. 12-çukurlu bir tabla içindeki steri lamelleri ekleyin. lamelleri üzerinde çözünmüş PLL 300 uL ekleyin. inkübasyon 30 dakika sonra çözelti çıkarın. (- 2 ay kadar 1) Plakalar, 4 ° C'de bir sonraki kullanıma kadar muhafaza edilebilir. 10 mg / ml stok çözeltisi o hazırlanmasıF kollajenaz tip -20 ° C'de 300 uL IA ve mağaza alikotları. Kullanmadan önce Filtre. 24 saat İzolasyon önce Gerekli 3. Hazırlıklar MEEC kültürü için kollajen kaplı lamelleri hazırlayın. damıtılmış su içinde bir 0.02 M asetik asit solüsyonu (lamel başına 1 ml) hazırlayın. 50 ug / mL bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere 0.02 M asetik asit 12 mL kollajen 150 uL ekleyin. 12-çukurlu bir tabla içindeki steri lamelleri ekleyin. kolajen çözeltisi 1 mL (3.1.2) ekleyin. 37 ° C sıcaklıkta O / N (en az 12 saat) inkübe edin. Izolasyon sırasında: emme lamelleri kapalı kollajen çözüm çıkarın ve (laminer akış kabini içinde) steril bir ortamda o hava kurumaya bırakın. Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez lamelleri yıkayın. 10 ml içeren 15 ml standart bir tüp içinde 0.25 g pankreatin ekleyerek% 2.5 pankreatin çözeltisi hazırlayınHBSS +. çözünürlüğünü arttırmak için, 1 saat boyunca (200 rpm) 37 ° C'da, çözelti çalkalayın. 4 ° C'de saklayın. 4. İzolasyon ve Fare endometrial epitel hücreleri Kültür (MEEC) ve Fare Endometrial Stromal hücreler (MESC) (Daha MESC sindirim karışımı olarak adlandırılır)% 0.25 tripsin içeren nihai çözelti ile sonuna kadar% 2.5 pankreatin çözeltisi (3.2) ihtiva eden 15 ml bir tüp içinde tripsin 25 mg ekleyin. Uteri izolasyonu vajinal smear incelemesinin hayvanların döngüsü aşamasını kontrol edin. hayvan dizginlemek ve 50 ul PBS 3 nazikçe vajina yıkayın – 5 kez. Bir bardak slayt son floş toplayın. 10X veya 20X objektif kullanarak parlak alan mikroskobu altında malzemeyi inceleyin. Sadece kızışma aşamasında olan fareler kullanın. Bu aşama, vajinal lavajda bulunan kornifıye epitel hücrelerinin varlığı (Şekil 1 ile karakterize edilir </strong>). Böyle servikal dislokasyon veya CO 2 indüklenen narkoz gibi uygun bir yöntem kullanılarak hayvanları euthanize. steril bir ortam oluşturmak için% 70 etanol ile karkas püskürtün. Steril cerrahi aletler kullanarak, karın açın ve her iki rahim boynuzları görselleştirmek için bir kenara bağırsak itin. fallop tüpü altında en uzak ucunda uterin horn tut. Fallop tüpünden rahim boynuzları incelemek ve yağ ve bağ dokusu çıkarın. rahim vücudun üstünde uzak ucunda korna kesip HBSS + 3 mL ile 35 mm Petri kabı yerleştirin. tüm rahim boynuzları toplanana kadar diğer boynuz ve diğer hayvanlar için bu adımı yineleyin. ayrıca bir Stereoskop altında (HBSS + içinde) uterin boynuz temizleyin ve kalan tüm adipoz veya bağ dokusu kaldırmak. rahim lümen maruz ve inci yerine uzunlamasına açık rahim boynuzları CutTaze HBSS + ile yeni bir Petri kabındaki e boynuz. pankreatini ve tripsin içeren 15 ml tüp tüm rahim boynuzları aktarın. orbital çalkalayıcı (50 rpm) ile, 4 ° C'de 60 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin. çalkalamadan, 23 ° C (RT) 45 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin. çalkalamadan, 37 ° C (su banyosu) 15 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin. Öte yandan,% 0.05 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 2.7 mL, 1 mg / ml kollajenaz stokunun 300 uL çözülmesiyle MESC sindirim karışımı tercih. Not: Bundan sonra, daha fazla yalıtım adımları bir laminar akış kabini altında steril bir ortamda gerçekleştirilir. Fare Endometrial Epitel Hücre (MEEC) Kültür 2 saat kuluçkalamadan sonra, dikkatli bir şekilde yüzer solüsyonundan dökün. Tripsin inaktive etmek için soğuk MEEC ortam içeren bir Petri kutusu içine uteri aktarın ve 5 dakika boyunca inkübeaktivite. soğuk HBSS + 3 mL içeren 15 ml tüp uteri aktarın. 10 sn için vorteks epitel kağıtları açmak için. 3 ml HBSS + ile temiz bir Petri kabındaki uterus durulayın. Adımı tekrarlayın 4.3.2 – 4.3.4 epitel tablolarını içeren üç süspansiyonlar toplam elde etmek. MESC sindirim karışımı uteri aktarın ve (200 rpm) çalkalayarak 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika inkübe edilir (Mesc daha izolasyonu için 4.4 adıma git). Doku enkaz kaldırmak için 100 mikron naylon örgü hafifçe üç hücre süspansiyonları pipetleme epitel yaprak kurtarın. 5 dakika boyunca 500 xg'de toplanan hücre süspansiyonu santrifüj. MEEC ortamı 12 mL pelet yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın. gravite sedimantasyon kullanılarak geri kalan Mesc ayırmak için 5 dakika boyunca çözeltiden yerleşirler. 5 ml pipet kullanarak dikkatlice üst 2 mL çıkarın. Hücre suspensio santrifüjn, 5 dakika boyunca 500 xg'de. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme MEEC ortamda süspanse. Diğer deneylerde (Şekil 2a) için istenen yoğunluğa kollajen kaplı lamelleri, hücreler plaka. 12 saat en az% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri. Not: RNA veya protein izolasyon arzu edildiğinde, bir 6-yuvalı plaka tohumlama tavsiye edilirken immün veya floresan kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel deneylerde, bu lamelleri, hücreleri doğrudan doğruya levha için tavsiye edilir. Fare endometriyal stromal hücrelerin izolasyonu yetersiz tek bir sindirimden sonra hücre saflığı iki tur ayrılmıştır. rahimler optimal hücre iyileşme ve saflık için iki kez sindirilir. Her iki turda da teknik müdahaleler aynıdır. araştırmacı tarafından istenen her iki turda toplanan hücreler, daha fazla deneyler için muhafaza edilebilir. Fare Endometrial Stromal Hücre (MESC) Kültür: 1. Yuvarlak İlk sindirim ayağı başlamadan önce, 2.7 mi,% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi içinde 1 mg / ml kollajenaz stokunun 300 uL eritilerek ikinci bir sindirim karışımı hazırlayın. Bu karışım aşama 4.4.8 gereklidir. soğuk (4 ° C) HBSS + ve MESC ortamının 3 mL, 3 x 15 ml tüpler (tüp, X1, X2 ve X3) ile üç kültür kaplarına hazırlayın. inkübasyon 30 dakika sonra, 10 saniye için hafifçe rahim içeren tripsin solüsyonu sallayın. MESC hücreleri rahim dokusu ayırmak ve tripsin çözeltisi içinde kalır. soğuk (4 ° C) HBSS + 3 mL içeren ilk Petri kabı uterus aktarın ve iyice durulayın. tripsin aktivitesi inhibe başlangıçta (adım 4.4.3 tüp) rahim boynuzları içeren tüp MESC orta 3 mL ekleyin. HBSS + MESC ortamının 3 mL içeren tüp X1 soğuk (4 ° C) Petri kabı rahimleri aktarın ve 10 sn için hafifçe çalkalanır. </li> Tekrarlayın 4.4.4 (soğuk (4 ° C ile Petri kabı transfer) HBSS +) ve iki kez 4.4.6 (tüp X2 ve X3 transfer) yineleyin. Not: Son olarak, bu protokol, 4 hücre süspansiyonları neden olur: bir boru tripsin solüsyonu ve Mesc içeren MESC ortam ile 3 tüp (tüpler, X1, X2 ve X3) ihtiva etmektedir. Aşama 4.4.1 de tarif edildiği gibi, yeni MESC sindirime uteri aktarın ve dikey olarak, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. 40 mikron naylon örgü ile dört hücre süspansiyonları geçerek stromal hücreler toplayın. Mesc ek 5 ml ile örgü durulayın. 7 dakika boyunca 500 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj. istenen yoğunluğa sahip başka deneyler için PLL kaplı lamelleri Mesc ve plakadaki pelletini. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 6 saat ve O / N 4 – en az inkübe edin. Fare Endometrial Stromal Cell (MESC) Kültür: 2. Yuvarlak <ol> soğuk (4 ° C) HBSS + ve MESC ortamının 3 mL, 3 x 15 ml tüpler (Borular, Y1, Y2 ve Y3) ile üç kültür kaplarına hazırlayın. 4.4.7 – Tekrar 4.4.3 adımları. 40 mikron naylon örgü uteri ile birlikte son hücre süspansiyonu aktarın. naylon gözlü bir tüp Y1, Y2 ve Y3 içeriğini geçirilerek stromal hücreler toplanır. Mesc ek 5 ml ile örgü durulayın. 7 dakika boyunca 500 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj. Diğer deneylerde (Şekil 2b) için PLL kaplı lamelleri MESC orta ve plaka pelletini. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 6 saat 4 – en az inkübe edin. Not: RNA veya protein izolasyon arzu edildiğinde önerilir 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum ise immün veya floresan kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel deneylerde, bu lamelleri hücreleri plaka tavsiye edilir. 5. Vimentin/ Saf MEEC ve MESC Kültürlerin Doğrulama için Sitokeratin Çift Boyama lamelleri hücreleri Tohum. PBS orbital çalkalayıcı (50 rpm) üzerine, kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden 3 x 5 dk yıkayın. Olmayan bir karıştırıcı üzerinde 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) (Dikkat gösterilmelidir!) Hücreleri saptamak. çalkalayıcı (50 rpm) üzerine kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile 3 kez yıkanır. bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 10 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği. bir çalkalayıcı üzerinde PBS ile 3 kez yıkayın. bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca PBS içerisinde% 5 keçi serumu (GS) ile blok (50 rpm) bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 4 ° C'de (: 1: 500) ve monoklonal fare anti-insan pansitokeratin (1.000 1) tek klonlu tavşan anti-insan vimentin hücreleri inkübe edin. Antikorlar% 0.5 GS PBS içinde seyreltilir. bir çalkalama (50 rpm) ile, PBS ile yıkayın 3x. sekonder antikor ile inkübe hücreleri (1: 1,000% 0.5 GS) Alexa Fluor 488-bağlı anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488-konjugatbir çalkalayıcı üzerinde bir kapı anti-fare IgG. bir çalkalayıcı üzerinde PBS ile 3 kez yıkayın. Dağı DAPI ve kuru O / N ihtiva eden sulu montaj orta ile slaytlar. Oje ile slaytlar Seal ve daha sonra kullanmak üzere 4 ° C üzerinde tutmak (Şekil 2a, b). Bir Coculture Sistemde Vitro desidualizasyonda 6. Not: Dört ila beş hayvandan, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bir Coculture sistemi kurmak için gereklidir. tercihen bir laminer akış kabini altında steril bir ortamda aşağıdaki protokol ile devam edin. bir 24-çukurlu plaka epitel hücre izolasyonu (4.3 de tarif edildiği gibi), santrifüj ve / veya İnkübasyon sırasında hücre kültürü ekler hazırlayın. 24 oyuklu bir plaka içerisinde kuyu istenen miktarda içine MESC ortamı 400 uL – 200. Steril forseps kullanarak önceden doldurulmuş 24-kuyularda ekler yerleştirin. MEEC peletekler üzerinde MEEC orta ve bölmek (aşama 4.3.14) (çalışma hacmi: 150 – uç başına 300 uL). Kültür, bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler. stromal hücre izolasyonu ikinci tur (aşama 4.5.6) sonra, (hücre kültürü ekler ile uyumlu) bir 24-çukurlu plaka içinde stromal hücreler tohumu. oyuk başına 400 uL hücre süspansiyonu bir çalışma hacmi kullanın. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 6 saat – stromal hücreler en az 4 eklemesini sağlar. stromal hücreler tarafından kapanan ikinci 24 oyuklu plaka ilk 24 oyuklu plaka epitel hücreleri ile kaplı hücre kültürü ekler aktarın. sterilize forseps kullanın ya da sadece kendi asılı dibinde ekler dokunun. Kültür 3 bir süre için% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler -% 90 oranında konfluent – epitel hücreleri kadar 5 gün, bir tek-tabakalı ve stromal hücreler 80 elde oluşturur. Ayrıca, kullanımı Transepitelyal Elektrik Direnci (TEER)Grant ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bir ohm / epitel metre kullanımı ile epitel tek tabaka izlemek için. 7. 800-1000 civarında / kuyu değerleri epitel tek tabakalı konfluent dikkate yeterli. cam pipetler veya ince pipet ipuçlarını kullanarak 3 d – Gerekirse, orta her 2 değiştirin. ekler de orta değiştirmeden önce, (altta seribaşı) stromal hücrelerin orta değiştirme ile başlayın. 37 ° C'de önceden ısıtılmış bir hücre kültür ortamını kullanmak tavsiye edilir. Deney başlamadan önce in vitro desidualizasyonda ikna etmek için desidualizasyon ortamı hazırlayın. stromal hücrelerin oyuk başına 400 uL bir çalışma hacmi kullanın. -20 ° C'de aşağıdaki stok çözümleri ve mağaza alikotları hazırlayın. etanol 250 uM medroksiprogesteron 17-asetat (MPA) hazırlayın. 100 mM stok çözeltisi, 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-ultra saf su içinde cAMP'yi hazırlayın. 1 uM MPA ve% 2 FBS içeren MESC ortamı içinde 0.5 mM cAMP ihtiva eden desidual tanesidir. Yavaşça kuyulardan orta kaldırmak ve stromal hücreleri üzerine desidual orta ekleyin. bir kontrol durumu gerekli ise,% 2 FBS içeren MESC ortamını kullanmak. hücre kültürü ekler orta çıkarın ve hücreler üzerine MEEC orta 300 mcL ekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde 5 gün boyunca hücrelerin inkübe edin. Beşinci gün sonra, RT-qPCR stromal hücrelerde desidualizasyon ölçüde değerlendirmek (aşağıya bakınız). Resazurin tabanlı canlılığı bir reaktif kullanılarak epitel hücrelerin canlılığını doğrula. MEEC ortamda yaşama güçlerine reajanı 1:10 çözeltisi hazırlayın. Yeni 24-yuvalı plaka içine hücre kültür ekleri aktarın. hücreleri üzerine MEEC solüsyon – canlılığı reaktifi 300 uL – 150 ekleyin. De% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edinEn az 4-5 saat veya gece boyunca ve (mor / pembe mavi) bir renk değişimine gözlemleyerek hücre canlılığını değerlendirmek. NOT: araştırmacı tarafından tercih edildiği gibi sidualizasyonu ayrıca, bir fare prolaktin spesifik ELISA yöntemi ile değerlendirilebilir. Mah-PCR ile sidualizasyonu ve 7.Validation Not: QRT-PCR ile desidualizasyon geçerli olabilmesi için, bu RNA analizi için bir hücre yeterli miktarda almak için iki kez tüm test koşulları gerçekleştirmek tavsiye edilir. De Clercq ve arkadaşları, daha önce tarif edildiği gibi kantitatif RT-PCR gerçekleştirilir. 8. Kısaca: ticari RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole. sırasıyla, üreticinin protokolüne göre, ticari yöntemlerle RNA miktarını ve kalitesini değerlendirmek. toplam RNA'nın 1 | ig itibaren üreticinin protokolüne uygun olarak, cDNA sentez. QRT-PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için, üreticinin protokolüne uygun olarak, ticari bir kit kullanın. üç nüsha tüm örnekleri çalıştırın. reaksiyonu yürütmek için istenen temizlik genler ve prolaktin (prl8a2) ticari TaqMan Master Mix ve spesifik TaqMan probları yararlanın.