Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em> In Vitro</em> decidualizzazione

AlexaFluor Tutti gli esperimenti sugli animali per questo studio sono stati approvati dal comitato etico della KU Leuven (Belgio) (Progetto P174 / 2013). I topi sono stati alloggiati in condizioni standard, con ad libitum accesso a pellet cibo e acqua del rubinetto, e tenuti in condizioni controllate (23 ± 1,5 ° C, umidità relativa 40 – 60%, 12/12 luce / buio ciclo). 1. topi Utilizzare disponibili in commercio ceppo di topi (cioè C57Bl / 6, femmina 8 – 12 settimane). Tipicamente, 4 – 5 topi produrranno una quantità appropriata di cellule per ulteriori esperimenti. Iniettare topi intatti via sottocutanea con 100 ml di 17β-estradiolo (E2) soluzione (100 ng / 100 ml) per 3 consecutivi d prima all'isolamento per standardizzare la fase del ciclo estrale degli animali e di indurre proliferazione di endometriale cellule. La necessità di controllare la fase del ciclo dei topi prima di iniziare il protocollo è essere evitabilecausa 3 d trattamento estradiolo '. 2. preparati Fare una soluzione di 100 ng / 100 ml E2 in olio di arachidi. Per le iniezioni di cinque topi (come descritto in 1.2), è necessaria una quantità di 1,5 mL. Sciogliere 1 mg E2 in 1 mL di etanolo per avere una soluzione stock di 1 mg / mL. Diluire questa soluzione, 1: 1.000 in olio di arachidi. Fai 500 ml di soluzione di Hank salina bilanciata (HBBS) 1x integrato con 100 U / mL di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (in seguito indicato come HBSS +). Fare 500 ml di filtrato cellulare mouse endometriale stromale (MESC) medio alla cultura MESC: Dulbecco Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) con rosso fenolo, L-glutammina e 4- (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico acido N – (2-idrossietil) piperazine- N '- (acido 2-etansolfonico) (HEPES) contenente 10% FBS, 0,5 mg / mL amfotericina B, e 100 mg / mL di gentamicina (further indicato come mezzo MESC). Fare 500 ml di filtrato media MESC 2% alla cultura MESC durante decidualizzazione: DMEM / F12 con rosso fenolo, L-glutammina e HEPES contenente 2% FBS, 0,5 mg / ml amfotericina B, e 100 mg / ml gentamicina. Preparare 500 ml di filtrato cellulare mouse endometriale epiteliale (MEEC) mezzo: DMEM contenente 10% FBS, 0,5 mg / ml amfotericina B, 100 mg / ml gentamicina, il 25% MCDB-105 di media, e 5 mg / ml di insulina (in seguito denominato come mezzo MEEC). Preparare vetrini Poli-L-lisina (PLL) rivestiti per la cultura MESC. Disciogliere 25 mg di PLL in 250 mL di acqua distillata. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micron. Aggiungere coprioggetto sterili in un 12-pozzetti. Aggiungere 300 ml di disciolto PLL sui vetrini. Rimuovere la soluzione dopo 30 min di incubazione. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo (fino a 1 – 2 mesi). Preparare un 10 mg / mL di soluzione of tipo collagenasi IA e memorizzare aliquote di 300 ml a -20 ° C. Filtrare prima dell'uso. 3. preparativi necessari 24 ore prima di isolamento Preparare collagene vetrini rivestiti per la cultura MEEC. Preparare una soluzione di acido acetico 0,02 M in acqua distillata (1 ml per vetrino). Aggiungere 150 microlitri collagene in 12 ml di 0,02 M di acido acetico per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / mL. Aggiungere coprioggetto sterili in un 12-pozzetti. Aggiungere 1 ml di soluzione di collagene (vedi 3.1.2). Incubare O / N (minimo 12 ore) a 37 ° C. Durante l'isolamento: Rimuovere la soluzione di collagene fuori i coprioggetti mediante aspirazione e lasciare asciugare in un ambiente sterile (nella cappa a flusso laminare). Lavare i coprioggetti due volte con fosfato-Buffered Saline (PBS). Preparare una soluzione pancreatina 2,5% aggiungendo 0,25 g pancreatina in un tubo canonica 15 mL contenente 10 mL diHBSS +. Agitare (200 rpm) la soluzione a 37 ° C per 1 h per aumentare la solubilità. Conservare a 4 ° C. 4. isolamento e la coltura di cellule di topo endometriale epiteliali (MEEC) e mouse endometriale stromali Cells (MESC) Aggiungere 25 mg di tripsina in un tubo da 15 ml contenente soluzione pancreatina 2,5% (v 3.2) per finire con una soluzione finale contenente 0,25% tripsina (in seguito denominata mix digestione MESC). Isolamento della cervice Controllare la fase del ciclo degli animali con un esame striscio vaginale. Trattenere l'animale e lavare la vagina delicatamente con 50 microlitri di PBS 3 – 5 volte. Raccogliere il colore finale su un vetrino. Esaminare il materiale sotto un microscopio campo chiaro utilizzando un obiettivo 10X o 20X. Utilizzare solo topi che sono in fase di estro. Questa fase è caratterizzata dalla presenza di cellule epiteliali cornified nella lavanda vaginale (Figura 1 </strong>). Eutanasia gli animali usando un metodo appropriato, come dislocazione cervicale o di CO 2 narcosi indotta. Spruzzare le carcasse con il 70% di etanolo per generare un ambiente sterile. L'utilizzo di strumenti chirurgici sterili, aprire l'addome e spingere l'intestino da parte di visualizzare entrambe le corna uterine. Afferra il corno uterino alla fine più distale sotto la tuba di Falloppio. Sezionare le corna uterine dalla tuba di Falloppio e rimuovere il tessuto adiposo e tessuto connettivo. Tagliare il corno alla fine distale di sopra del corpo uterino e posizionarlo in 35 mm piastra di Petri con 3 ml di HBSS +. Ripetere questo passaggio per l'altro corno e per gli altri animali fino a quando tutte le corna uterine sono raccolti. Pulire il corno uterino (in HBSS +) ulteriormente sotto uno stereoscopio e rimuovere tutti adiposo residua o del tessuto connettivo. Tagliare le corna uterine aperte longitudinalmente per esporre il lume uterino e sostituire °e corno in una nuova capsula di Petri con fresco HBSS +. Trasferire tutte le corna uterine al tubo da 15 ml contenente pancreatina e tripsina. Incubare orizzontalmente per 60 min a 4 ° C in un agitatore orbitale (50 rpm). Incubare in orizzontale per 45 minuti a 23 ° C (RT), senza agitare. Incubare orizzontalmente per 15 minuti a 37 ° C (bagno d'acqua), senza agitare. Intanto rendere la miscela di digestione MESC sciogliendo 300 ml di 1 mg / ml di collagenasi magazzino in 2,7 mL di soluzione di 0,05% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA). NOTA: Da ora in poi, ulteriori misure di isolamento vengono eseguite in un ambiente sterile sotto una cappa a flusso laminare. Mouse endometriale cellule epiteliali (MEEC) Cultura Dopo 2 ore di incubazione, con attenzione versare via la soluzione surnatante. Trasferire il uteri in una capsula di Petri contenente medio MEEC freddo e incubare per 5 minuti al fine di inattivare la tripsinaattività. Trasferire il uteri ad una provetta da 15 ml contenente 3 ml di HBSS freddo +. Vortex per 10 s per liberare i fogli epiteliali. Sciacquare il uteri in un piatto pulito Petri con 3 ml HBSS +. Ripetere passaggio 4.3.2 – 4.3.4 per ottenere un totale di tre sospensioni contenenti fogli epiteliali. Trasferire il uteri al mix digestione MESC e incubare per 30 minuti a 37 ° C agitando (200 rpm) (andare al punto 4.4 per un ulteriore isolamento di MESC). Recuperare i fogli epiteliali pipettando tre sospensioni cellulari dolcemente su una maglia di nylon 100 micron per rimuovere i residui di tessuto. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta a 500 xg per 5 min. Risospendere il pellet in 12 ml di terreno MEEC e mescolare bene. Settle la soluzione per 5 minuti per separare restante MESC mediante sedimentazione per gravità. Rimuovere con attenzione le superiori 2 mL utilizzando una pipetta da 5 ml. Centrifugare la suspensio cellularen a 500 xg per 5 min. Risospendere in media MEEC pipettando gentilmente su e giù. Piastra le cellule su vetrini collagene rivestite con la densità desiderata per ulteriori esperimenti (Figura 2a). Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per almeno 12 h. NOTA: per immunocolorazione o esperimenti funzionali come l'imaging di calcio a fluorescenza, si consiglia di placcare le cellule direttamente sui vetrini, mentre semina in un 6-pozzetti è consigliato quando l'RNA o proteine ​​isolamento è desiderato. Isolamento di cellule stromali endometriali topo è diviso in due giri come la purezza delle cellule dopo una sola digestione può essere insufficiente. Gli uteri sono digeriti due volte per un recupero cellulare ottimale e la purezza. In entrambi i turni gli interventi tecnici sono identici. Le cellule raccolte da entrambi i turni possono essere conservati per ulteriori esperimenti, se lo desideri dal ricercatore. Mouse endometriale Strcellulare OMAL (MESC) Cultura: 1 ° Turno Prima dell'inizio del primo turno digestione, preparare una seconda miscela di digestione sciogliendo 300 ml di 1 mg / ml di collagenasi magazzino in 2,7 ml di soluzione 0,05% tripsina-EDTA. Questo mix è necessaria nella fase 4.4.8. Preparare tre piccole piastre di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS 3 x 15 mL con 3 ml di terreno MESC (tubo X1, X2 e X3) + e. Dopo 30 min di incubazione, agitare la soluzione tripsina uteri contenente delicatamente per 10 s. cellule Mesc si staccheranno dal tessuto uterino e rimarranno nella soluzione tripsina. Trasferire il uteri alla prima piastra di Petri contenente 3 ml di freddo (4 ° C) HBSS + e risciacquare bene. Aggiungere 3 ml di terreno MESC alla provetta contenente in origine le corna uterine (tubo in fase 4.4.3) di inibire l'attività tripsina. Trasferire il uteri dalla piastra di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS + per tubo X1 contenente 3 ml di terreno MESC e agitare delicatamente per 10 s. </li> Ripetere i punti 4.4.4 (trasferimento in una capsula di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS +) e 4.4.6 (trasferimento di X2 e X3 tubo) due volte. NOTA: Per concludere, questo protocollo si tradurrà in 4 sospensioni cellulari: una provetta contenente la soluzione tripsina e 3 tubi con terreno contenente MESC MESC (tubi X1, X2 e X3). Trasferire uteri nel nuovo digestione MESC, come descritto nel passaggio 4.4.1 e incubare per 30 min a 37 ° C, in verticale. Raccogliere le cellule stromali passando quattro sospensioni cellulari attraverso una maglia di nylon 40 micron. Risciacquare la rete con altri 5 ml di MESC. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 7 minuti. Risospendere il pellet in MESC e piatto su vetrini PLL-rivestite per ulteriori esperimenti con la densità desiderata. Incubare per un minimo di 4 – 6 h o O / N a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Mouse endometriale stromale cellulare (MESC) Cultura: 2 ° Turno <ol> Preparare tre piccole piastre di Petri con il freddo (4 ° C) HBSS 3 x 15 mL con 3 ml di terreno MESC (Tubi Y1, Y2 e Y3) + e. Ripetere i punti 4.4.3 – 4.4.7. Trasferire l'ultima sospensione cellulare insieme cervice ad una rete di nylon 40 micron. Raccogliere le cellule stromali passando il contenuto del tubo Y1, Y2 e Y3 attraverso la maglia di nylon. Risciacquare la rete con altri 5 ml di MESC. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 7 minuti. Risospendere il pellet in media MESC e piastra su vetrini PLL-rivestite per ulteriori esperimenti (Figura 2b). Incubare per un minimo di 4 – 6 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: per immunocolorazione o esperimenti funzionali come l'imaging di calcio a fluorescenza, si consiglia di placcare le cellule su vetrini, mentre semina in un 6-pozzetti è consigliato quando l'RNA o proteine ​​isolamento è desiderato. 5. Vimentin/ Citocheratina doppia colorazione per la convalida dei MEEC pura e culture Mesc Seme le cellule su vetrini. Lavare 3 x 5 min con PBS contenente calcio e magnesio su agitatore orbitale (50 rpm). Fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) (ATTENZIONE!) Per 10 minuti, non su agitatore. Lavare 3x con PBS senza calcio e magnesio su agitatore (50 rpm). Permeabilize le cellule con 0,2% Triton X-100 per 10 minuti su un agitatore (50 rpm). Lavare 3x con PBS su un agitatore. Block con siero 5% di capra (GS) in PBS per 2 h in un agitatore (50 rpm) Incubare le cellule con anticorpi monoclonali di coniglio anti-vimentina umana (1: 500) e monoclonale di topo pancytokeratin anti-umano (1: 1.000) a 4 ° C in un agitatore (50 rpm). Gli anticorpi sono diluiti in PBS con 0,5% GS. Lavare 3x con PBS in un agitatore (50 rpm). Incubare le cellule con anticorpi secondari (1: 1.000 in 0,5% GS) Alexa Fluor 488 coniugato IgG anti-coniglio e Alexa Fluor 488-conjugated IgG anti-topo su un agitatore. Lavare 3x con PBS su un agitatore. Montare i vetrini con mezzo di montaggio acquoso contenente DAPI e O secca / N. Sigillare i vetrini con smalto e continuare a 4 ° C per un ulteriore uso (Figura 2a, b). 6. In Vitro decidualizzazione in un sistema coculture NOTA: quattro a cinque animali sono tenuti a stabilire un sistema di co-coltura in una piastra da 24 pozzetti. Continuare con il seguente protocollo in un ambiente sterile, preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare. Preparare gli inserti di coltura cellulare durante la centrifugazione e / o incubazione fasi del isolamento delle cellule epiteliali (come descritto in 4.3) in una piastra da 24 pozzetti aggiuntivo. Aggiungere 200 – 400 ml di mezzo MESC nella quantità desiderata di pozzetti della piastra da 24 pozzetti. Mettere gli inserti nei preriempite 24 pozzi con pinza sterile. Risospendere il pellet MEEC(Volume di lavoro: 150 – 300 ml per inserto) (passo 4.3.14) in media MEEC e si dividono nel corso degli inserti. Coltivare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Seme le cellule stromali in un altro 24-pozzetti (compatibile con gli inserti colture cellulari) dopo il secondo turno di isolamento delle cellule stromali (fase 4.5.6). Utilizzare un volume di lavoro di 400 microlitri sospensione cellulare per pozzetto. Lasciare le cellule stromali di allegare per almeno 4 – 6 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Trasferire gli inserti di coltura cellulare coperti con le cellule epiteliali dal primo 24-pozzetti nel secondo 24-pozzetti coperti da cellule stromali. Utilizzare pinze sterilizzate o toccare gli inserti solo ai loro piedi impiccagione. Cultura le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per un periodo da 3 – 5 d finché le cellule epiteliali formano un monostrato e le cellule stromali soddisfare l'80 – 90% di confluenza. Inoltre, utilizzare il Transepithelial Resistenza elettrica (TEER)monitorare il monostrato epiteliale mediante l'uso di un misuratore epiteliale Volt / Ohm come descritto da Grant et al. 7. I valori di 800-1000 / pozzetto sono stati sufficienti a considerare l'confluenti monostrato epiteliale. Se necessario, sostituire la media ogni 2 – 3 d utilizzando pipette di vetro o puntali sottili. Iniziare con la sostituzione del mezzo delle cellule stromali (seminate in basso), prima di sostituire il mezzo negli inserti. Si raccomanda di utilizzare preriscaldato mezzo di coltura cellulare a 37 ° C. Preparare il supporto decidualizzazione per indurre in decidualizzazione vitro prima di iniziare l'esperimento. Utilizzare un volume di lavoro di 400 microlitri per pozzetto di cellule stromali. Preparare le seguenti soluzioni madre e aliquote conservare a -20 ° C. Preparare 250 pM medrossiprogesterone 17-acetato (MPA) in etanolo. Preparare 100 Soluzione mm 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cAMP in acqua ultrapura. Rendere il medium deciduali contenente 1 mM MPA e 0,5 mM cAMP nel medio MESC contenente il 2% FBS. Rimuovere delicatamente il supporto dai pozzi e aggiungere il supporto deciduali sulle cellule stromali. Se è necessaria una condizione di controllo, utilizzare il mezzo MESC contenente il 2% FBS. Rimuovere il supporto dagli inserti di coltura cellulare e aggiungere 300 ml di media MEEC sulle celle. Incubare le cellule per 5 d in un incubatore a 37 ° C in 5% CO 2. Dopo il quinto giorno, valutare il grado di decidualizzazione nelle cellule stromali mediante RT-qPCR (vedi sotto). Convalidare la vitalità delle cellule epiteliali utilizzando il reagente fattibilità resazurina-based. Preparare una soluzione 1:10 di reagente viabilità in media MEEC. Trasferire gli inserti di coltura cellulare in un nuovo 24-pozzetti. Aggiungere 150 – 300 ml di reagente fattibilità – soluzione MEEC sulle celle. Incubare a 37 ° C in CO 2 5% per un periodoalmeno 4-5 ore o durante la notte e di valutare la vitalità cellulare osservando un cambiamento di colore (blu al viola / rosa). NOTA: decidualizzazione può anche essere valutata utilizzando un mouse prolattina-specifici ELISA, come preferito dal ricercatore. 7.Validation di decidualizzazione da qRT-PCR NOTA: Per validazione del decidualizzazione da qRT-PCR, si raccomanda di eseguire tutte provini condizioni in duplicato per ricevere una quantità sufficiente di cellule per l'analisi dell'RNA. RT-PCR quantitativa viene eseguita come descritto in precedenza in De Clercq et al. 8. In breve: Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento di RNA commerciale. Valutare la quantità e la qualità del RNA utilizzando metodi commerciali secondo il protocollo del produttore, rispettivamente. Sintetizzare cDNA, secondo il protocollo del produttore a partire dal 1 mg di RNA totale. Utilizzare un kit commerciale secondo il protocollo del produttore per effettuare la reazione di qRT-PCR. Eseguire tutti i campioni in triplice copia. Fare uso del commerciale TaqMan Master Mix e sonde TaqMan specifiche per i geni housekeeping desiderati e prolattina (prl8a2) per effettuare la reazione.