בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em> במבחנה</em> Decidualization

AlexaFluor כל הניסויים בבעלי חיים לצורך מחקר זה אושרו על ידי ועדת הביקורת האתית של לובן KU (בלגיה) (פרויקט P174 / 2013). עכברים שוכנו בתנאים סטנדרטיים, עם גישה כרצונך מודעה כדי כדורי מזון ומי ברז, והמשיכו בתנאים מבוקרים (23 ± 1.5 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 40 – 60%, 12/12 מחזור אור / חושך). 1. עכברים לשימוש מסחרי זן עכבר זמין (כלומר C57Bl / 6, נקבה 8 – בן 12 שבועות). בדרך כלל, 4 – 5 עכברים יניבו כמות מתאימה של תאים עבור ניסויים נוספים. להזריק עכברים שלמים מתחת לעור עם 100 μL של-אסטרדיול 17β (E2) פתרון (100 ng / 100 μL) עבור 3 ברציפות ד לפני הבידוד כדי לתקנן את השלב של מחזור הייחום של החיות כדי לגרום לשגשוג של רירית הרחם תאים. הצורך לבדוק בשלב המחזור של העכברים לפני תחילת הפרוטוקול זה להיות מיותרסיבת הטיפול אסטרדיול 3 ד '. 2. תכשירים בצע פתרון של 100 ng / 100 μL E2 ב arachis שמן. את הזריקות של חמישה עכברים (כמתואר 1.2), בסכום של 1.5 מ"ל הוא זקוק. ממיסים 1 מ"ג E2 ב 1 אתנול מ"ל יש פתרון המניות של 1 מ"ג / מ"ל. לדלל פתרון מניות זה 1: 1,000 בשמן arachis. הפוך 500 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBBS) 1x השלימו עם 100 פניצילין U / mL ו -100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (המכונה נוספת כמו HBSS +). הפוך 500 מ"ל של תא מסונן עכבר רירית הרחם סטרומה (המסקלין) בינוני עד המסקלין תרבות: F12 תערובת בינוני הנשר שונה של Dulbecco / מזון (DMEM / F12) עם פנול אדום, L- גלוטמין ו 4- (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה, N – (2-Hydroxyethyl) piperazine- N '- (חומצה 2-ethanesulfonic) (HEPES) המכיל 10% FBS, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B, ו- 100 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין (פוrther המכונה בינוני המסקלין). הפוך 500 מ"ל של מדיום המסקלין מסונן 2% לתרבות המסקלין במהלך decidualization: DMEM / F12 עם פנול אדום, L- גלוטמין ו HEPES המכיל 2% FBS, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B, ו- 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין. הכן 500 מ"ל של תא מסונן עכבר רירית הרחם אפיתל (MEEC) בינוני: DMEM המכיל 10% FBS, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B, 100 מיקרוגרם / גנטמיצין מ"ל, 25% MCDB-105 בינוני, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין (המכונה נוספת כמדיום MEEC). כן פולי- L- ליזין (PLL) coverslips מצופה לתרבות המסקלין. ממיסים 25 מ"ג של PLL ב 250 מ"ל של מים מזוקקים. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף coverslips סטרילי בצלחת 12-היטב. הוספת 300 μL של מומס PLL על coverslips. הסר את הפתרון לאחר 30 דקות של דגירה. הצלחות יכולות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף (עד 1 – 2 חודשים). הכן פתרון המניות 10 מ"ג / מ"ל ​​oסוג collagenase ו IA ולאחסן aliquots של 300 μL ב -20 ° C. מסנן לפני השימוש. 3. הכנות דרושות 24 שעות לפני הבידוד כן coverslips קולגן מצופה לתרבות MEEC. הכן פתרון חומצה 0.02 M אצטית במים מזוקקים (1 מ"ל לכל coverslip). הוספת 150 μL הקולגן 12 מ"ל של 0.02 M חומצה אצטית כדי לקבל ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף coverslips סטרילי בצלחת 12-היטב. הוסף 1 מ"ל של הפתרון קולגן (ראה 3.1.2). דגירה O / N (h 12 מינימום) על 37 מעלות צלזיוס. במהלך בידוד: הסר את הפתרון קולגן את coverslips על ידי שאיבה ולתת לו אוויר יבש בסביבה סטרילית (בקבינט זרימה למינרית). שטפו את coverslips פעמיים עם בופר פוספט (PBS). הכן פתרון 2.5% pancreatin על ידי הוספת 0.25 גרם pancreatin בתוך שפופרת הקנונית 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל שלHBSS +. Shake (200 סל"ד) הפתרון על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להגדיל את המסיסות. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. בידוד 4. והתרבות של תאי אפיתל רירית רחם העכבר (MEEC) ועכבר רירית רחם סטרומה תאים (המסקלין) הוסף 25 מ"ג של טריפסין בתוך שפופרת 15 מ"ל המכיל פתרון 2.5% pancreatin (ראה 3.2) כדי לגמור עם הפתרון הסופי המכיל טריפסין 0.25% (המכונה נוספת כמו תערובת העיכול המסקלין). בידוד של uteri בדוק את שלב המחזור של החיות עם בחינה למרוח בנרתיק. לרסן את החיה ולשטוף את הנרתיק בעדינות עם 50 μL PBS 3 – 5 פעמים. אסוף את הסומק הסופי בשקופית זכוכית. בדוק את החומר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 10X או 20X. רק משתמשים בעכברים כי נמצאים בשלב ייחום. שלב זה מאופיין על ידי נוכחות של תאים cornified אפיתל של שטיפה וגינלית (איור 1 </strong>). להרדים את החיות באמצעות השיטה המתאימה כגון נקע בצוואר הרחם או CO 2 הרדמה -induced. רסס את הפגרים עם 70% אתנול על מנת לייצר סביבת סטרילית. שימוש בכלי ניתוח סטרילי, לפתוח את הבטן ולדחוף את המעיים הצידה כדי להמחיש הן קרני הרחם. תפוס את קרן הרחם בקצה הדיסטלי ביותר תחת החצוצרה. לנתח את קרני הרחם מן החצוצרה ולהסיר שומן ורקמת חיבור. חותכים את הצופר בקצה הדיסטלי מעל לגוף הרחם ומניחים אותו בצלחת פטרי 35 מ"מ עם 3 מ"ל של HBSS +. חזור על שלב זה עבור הקרן השנייה ועבור חיות האחרות עד שכל קרן הרחם נאספת. נקו את קרן הרחם (ב HBSS +) נוסף תחת stereoscope ולהסיר את כל השומן שיורית או רקמת חיבור. חותכים את קרני הרחם פתוח longitudinally לחשוף את לומן הרחם ולהחליף הצופר דואר בצלחת פטרי חדשה עם + HBSS הטרי. להעביר את כל קרני הרחם עד 15 הצינור מ"ל המכיל pancreatin טריפסין. דגירה אופקית במשך 60 דקות ב 4 ° C על שייקר מסלולית (50 סל"ד). דגירה אופקית במשך 45 דקות ב 23 ° C (RT), בלי לרעוד. דגירה אופקית במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (אמבט מים), בלי לרעוד. בינתיים לעשות את המיקס העיכול המסקלין ידי המסת 300 μL של המניה 1 מ"ג / מ"ל ​​collagenase ב 2.7 מ"ל של 0.05% טריפסין- Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון. הערה: מעתה ואילך, צעדי בידוד נוספים מבוצעים בסביבת סטרילית מתחת לארון זרימה למינרית. תא עכבר רירית הרחם אפיתל (MEEC) תרבות לאחר 2 שעות של דגירה, ובזהירות לשפוך משם הפתרון supernatant. מעבירים את uteri לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני MEEC קר דגירה במשך 5 דקות כדי להשבית טריפסיןפעילות. מעבירים את uteri לצינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של HBSS קר +. וורטקס למשך 10 שניות כדי לשחרר את הגיליונות אפיתל. שוטפים את uteri בצלחת פטרי נקי עם 3 מ"ל HBSS +. חזור על שלב 4.3.2 – 4.3.4 להשיג סכום כולל של שלוש השעיות המכילות גיליונות אפיתל. מעבירים את uteri לתערובת העיכול המסקלין דגירה במשך 30 דקות ב 37 ° C תוך רועד (200 סל"ד) (עבור לשלב 4.4 לבידוד נוסף של המסקלין). שחזור סדיני אפיתל ידי pipetting שלוש השעיות התא בעדינות על רשת ניילון 100 מיקרומטר כדי להסיר שאריות רקמה. צנטריפוגה השעית התא שנאספה ב XG 500 במשך 5 דקות. Resuspend גלולה ב 12 מ"ל של מדיום MEEC ומערבבים היטב. Settle הפתרון במשך 5 דקות על מנת להפריד המסקלין הנותרים באמצעות שקיעה הכבידה. הסר בזהירות את 2 מ"ל העליון באמצעות פיפטה 5 מ"ל. צנטריפוגה התא suspension ב XG 500 במשך 5 דקות. גלולה במדיום MEEC ידי pipetting מעלה מטה בעדינות. פלייט התאים על coverslips מצופה קולגן בצפיפות הרצויה עבור ניסויים נוספים (איור 2 א). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2 למשך תקופה מינימלית של 12 שעות. הערה: לקבלת immunostaining או ניסויים פונקציונליים כמו הדמית סידן פלורסנט, מומלץ צלחת התאים ישירות על coverslips, תוך זריעה בצלחת 6-היטב מומלצת כאשר RNA או חלבון הבידוד הוא רצוי. בידוד של תאי סטרומה עכבר רירית רחם מחולק לשני סיבובים כמו הטוהר של התאים לאחר רק עיכול אחד יכול להיות מספיק. Uteri מתעכל פעמים בגין הבראה אופטימלית תא וטוהר. בשני סיבובי ההתערבויות הטכניות זהות. תאים שנאספו סיבובים שניהם יכולים להישמר עבור ניסויים נוספים, לפי הצורך על ידי החוקר. עכבר רירית הרחם StrCell omal (המסקלין) תרבות: 1 st עגול לפני תחילת סיבוב העיכול הראשון, להכין תערובת עיכול שנייה על ידי המסת 300 μL של מניית 1 מ"ג / מיליליטר collagenase ב 2.7 מיליליטר 0.05% פתרון טריפסין- EDTA. תמהיל זה נחוץ בשלב 4.4.8. הכן שלוש צלחות פטרי קטנה עם קר (4 ° C) HBSS + ו -3 x 15 צינורות מ"ל עם 3 מ"ל של מדיום המסקלין (שפופרת X1, X2 ו X3). לאחר 30 דקות של דגירה, לנער את פתרון טריפסין המכיל uteri בעדינות במשך 10 שניות. תאי המסקלין תנתק מרקמת הרחם יישארו פתרון טריפסין. מעבירים את uteri המנה הראשונה פטרי המכילה 3 מ"ל קר (4 ° C) HBSS + ולשטוף היטב. הוסף 3 מ"ל של מדיום המסקלין אל הצינור במקור המכיל את קרני הרחם (צינור בשלב 4.4.3) לעכב פעילות טריפסין. מעבירים את uteri מצלחת פטרי עם קר (4 ° C) HBSS + כדי X1 צינור המכיל 3 מ"ל של מדיום המסקלין ולנער בעדינות במשך 10 שניות. </li> חזור על שלבים 4.4.4 (מעבירים לצלחת פטרי עם קר (4 ° C) HBSS +) ו 4.4.6 (העברת צינור X2 ו X3) פעמיים. הערה: לבסוף, פרוטוקול זה יגרום 4 השעיות תא: צינור אחד המכיל את פתרון טריפסין ו -3 צינורות עם מדיום המסקלין המכיל המסקלין (צינורות X1, X2 ו X3). העבר uteri בעיכול המסקלין החדש, כמתואר בשלב 4.4.1 דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, אנכית. אוסף את תאי סטרומה ידי העברת ארבעת המתלים התא דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר. שוטף את הרשת עם 5 מיליליטר נוסף של המסקלין. צנטריפוגה השעית התא XG ב 500 במשך 7 דקות. Resuspend גלול ב המסקלין צלחת על coverslips מצופה PLL עבור ניסויים נוספים עם הצפיפות הרצויה. דגירה למשך תקופה מינימלית של 4 – ח 6 או O / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. תא סטרומה עכבר רירית הרחם (המסקלין) תרבות: 2 nd עגול <ol> הכן שלוש צלחות פטרי קטנה עם קר (4 ° C) HBSS + ו -3 x 15 צינורות מ"ל עם 3 מ"ל של מדיום המסקלין (צינורות Y1, Y2 ו Y3). חזור על שלבי 4.4.3 – 4.4.7. מעביר את השעית התא האחרונה יחד עם uteri על רשת ניילון 40 מיקרומטר. אוספים את התאים סטרומה על ידי העברת התוכן של Y1 צינור, Y2 ו Y3 דרך רשת ניילון. שוטף את הרשת עם 5 מיליליטר נוסף של המסקלין. צנטריפוגה השעית התא XG ב 500 במשך 7 דקות. Resuspend גלולה במדיום צלחת המסקלין על coverslips מצופה PLL עבור ניסויים נוספים (איור 2b). דגירה למשך תקופה מינימלית של 4 – 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: לקבלת immunostaining או ניסויים פונקציונליים כמו הדמית סידן פלורסנט, מומלץ צלחת התאים על coverslips, תוך זריעה בצלחת 6-היטב מומלץ כאשר RNA או חלבון הבידוד הוא רצוי. Vimentin 5./ Cytokeratin זוגי מכתים עבור אימות של MEEC טהור ותרבויות המסקלין זרעים התאים על coverslips. לשטוף 3 x 5 דקות עם PBS המכיל סידן ומגנזיום על שייקר מסלולית (50 סל"ד). תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) (זהירות!) במשך 10 דקות, לא על שייקר. לשטוף 3x עם PBS ללא סידן ומגנזיום על שייקר (50 סל"ד). Permeabilize את התאים עם 0.2% Triton X-100 במשך 10 דקות על שייקר (50 סל"ד). לשטוף 3x עם PBS על שייקר. בלוק עם 5% עז בסרום (GS) ב- PBS עבור 2 שעות על שייקר (50 סל"ד) דגירת תאים עם vimentin אנטי אנושי ארנב חד שבטי (1: 500) ו pancytokeratin אנטי אנושי עכבר חד שבטי (1: 1,000) ב 4 ° C על שייקר (50 סל"ד). נוגדנים הם מדוללים PBS עם 0.5% GS. 3x לשטוף עם PBS על (סל"ד 50) שייקר. דגירה תאים עם נוגדנים משני (1: 1,000 ב -0.5% GS) Alexa פלואוריד 488 מצומדות נגד ארנב IgG ו אלקסה פלואוריד 488-conjuIgG אנטי עכבר מגודר על שייקר. לשטוף 3x עם PBS על שייקר. הר שקופיות עם הרכבה בינונית מימית המכילה DAPI ו- O יבש / N. חותם את השקופיות עם לק ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף (איור 2 א, ב). 6. במבחנה Decidualization בתוך מערכת Coculture הערה: ארבעה עד חמישה בעלי חיים נדרשים להקים מערכת coculture בצלחת 24 גם. המשך עם הפרוטוקול הבא בסביבת סטרילית, רצוי מתחת לארון זרימה למינרית. הכן את מוסיף תרבית תאים במהלך שלבי צנטריפוגה ו / או דגירה של בידוד תא אפיתל (כמתואר 4.3) ב צלחת 24 באר נוספת. הוספת 200 – 400 μL של מדיום המסקלין לתוך הכמות הרצויה של בארות בצלחת 24 גם. מניחים את מוסיף על 24 בארות prefilled באמצעות מלקחיים סטרילית. Resuspend גלולה MEEC(שלב 4.3.14) במדיום MEEC ומתחלקים על המחדיר (נפח עבודה: 150 – 300 μL לכל כנס). התרבות התאים על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2. זרעי תאי סטרומה ב עוד צלחת 24 גם (תואמים עם מוסיף תרבית תאים) לאחר הסיבוב השני של בידוד תא סטרומה (שלב 4.5.6). השתמש נפח עבודה של השעית תא 400 μL לכל טוב. אפשר תאי סטרומה לצרף מינימום 4 – ח 6 ב 37 מעלות צלזיוס חממת 2 5% CO. מעבירים את מוסיף תרבית תאים מכוסה תאי אפיתל מהצלחת 24 הבאר הראשונה לתוך צלחת 24 גם השני מכוסה על ידי תאי סטרומה. שימוש במלקחיים מעוקרים או לגעת מוסיף רק ברגל התלייה שלהם. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2 לתקופה של 3 – 5 ד עד לתאי האפיתל ליצור בשכבה ואת בתאי סטרומה להשיג 80 – 90% confluency. בנוסף לכך, השתמש בהתנגדות החשמלית Transepithelial (TEER)כדי לפקח על monolayer אפיתל על ידי שימוש מטר אפיתל וולט / אוהם כפי שתואר על ידי גרנט et al. 7. ערכים של 800-1,000 / גם היו די להידרש ומחוברות monolayer אפיתל. במידת הצורך, להחליף את מדיום כל 2 – ד 3 באמצעות טפטפות זכוכית או טיפים pipet בסדר. התחל עם החלפתו של המדיום של תאי סטרומה (זורע בתחתית), לפני ההחלפה הבינונית מוסיף. מומלץ להשתמש תרבית תאים בינוניים שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. הכן את המדיום decidualization כדי לעורר decidualization במבחנה לפני תחילת הניסוי. השתמש נפח עבודה של 400 μL לכל טוב של תאי סטרומה. הכן את פתרונות מניות aliquots במאגר הבאים ב -20 ° C. הכן 250 מיקרומטר medroxyprogesterone 17-אצטט (MPA) באתנול. הכן פתרון המניות 100 מ"מ 8-Bromoadenosine 3 ', 5'- cAMP במים ultrapure. הפוך את המדיום decidual המכיל MPA 1 מיקרומטר ו 0.5 מ"מ cAMP במדיום המסקלין המכיל 2% FBS. בעדינות להסיר את המדיום מבאר ולהוסיף מדיום decidual על גבי תאי סטרומה. אם מצב מלא יש צורך, להשתמש במדיום המסקלין המכיל 2% FBS. הסר את המדיום מן מוסיף תרבית תאים ולהוסיף 300 μL של מדיום MEEC על התאים. דגירה התאים למשך 5 ד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. אחרי היום החמישי, להעריך את היקף decidualization בתאי סטרומה על ידי RT-qPCR (ראה להלן). אמת את הכדאיות של תאי אפיתל באמצעות ריאגנט הכדאי המבוסס Resazurin. כן 1:10 פתרון של מגיב כדאיות במדיום MEEC. מעביר את מוסיף תרבית תאים לתוך צלחת 24-באר חדשה. הוספת 150 – 300 μL של מגיב הכדאיות – פתרון MEEC על התאים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשךלפחות 4 – כדאיות התא 5 שעות או למשך הלילה ולהעריך על ידי התבוננות שינוי צבע (כחול / ורוד סגול). הערה: Decidualization ניתן להעריך גם באמצעות עכבר פרולקטין ספציפי ELISA, כפי המועדפת על ידי החוקר. 7.Validation של Decidualization ידי qRT-PCR הערה: לקבלת אימות של decidualization ידי qRT-PCR, מומלץ לבצע את כל מבחן התנאים בשני עותקים על מנת לקבל כמות מספקת של תאים לניתוח RNA. RT-PCR כמותי מבוצעת כפי שתואר לעיל דה קלרק et al. 8. בקיצור: לבודד RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית. להעריך את הכמות והאיכות של ה- RNA באמצעות שיטות מסחר על פי פרוטוקול של היצרן, בהתאמה. לסנתז cDNA, על פי פרוטוקול של היצרן החל מיום 1 מיקרוגרם של רנ"א מוחלט. השתמש ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן לבצע את תגובת qRT-PCR. הפעל את כל הדגימות בשלושה עותקים. לעשות שימוש של מיקס מאסטר TaqMan המסחרי בדיקות TaqMan ספציפיות עבור גני המשק הרצויים ופרולקטין (prl8a2) כדי לבצע את התגובה.