マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために<em>インビトロ</em>脱落膜化

AlexaFluor この研究のための動物実験はすべてKUルーベン（ベルギー）（プロジェクトP174 / 2013）の倫理審査委員会によって承認されました。マウスは、食物ペレットへの随意アクセスを、標準条件下で飼育し、水道水、かつ制御された条件（23±1.5℃、相対湿度40から60パーセント、12月12日の明/暗サイクル）の下で維持しました。 1.マウス市販のマウス系統（ – 12週齢すなわち C57BL / 6、女性8）を使用します。典型的には4 – 5匹のマウスをさらなる実験のための細胞の適切な量が得られます。 動物の発情周期の位相を標準化すると子宮内膜の増殖を誘導するために、分離する前に3回連続日間17βエストラジオール（E2）溶液（100 ngの/ 100μL）100μLで皮下そのままマウスを注入細胞。プロトコルを開始する前に、マウスのサイクル段階をチェックする必要性が回避可能です3 D 'エストラジオール治療の原因。 2.準備落花生油中に100ng / 100μLE2の溶液を作ります。 5匹のマウス（1.2に記載されるように）の注射のために、1.5 mLの量が必要です。 1mg / mlのストック溶液を有するように1 mLのエタノール中に1mgのE2を溶かします。 この原液1を希釈：1,000落花生油中。 100 U / mLペニシリンおよび100μg/ mLのストレプトマイシン（さらにHBSS +とも呼ばれる）を補完ハンクス液（HBBS）1倍の500ミリリットルを加えます。 培養MESCへのフィルタリングマウス子宮内膜間質細胞の500ミリリットルを加えます（MESC）培地：フェノールレッド、L-グルタミン及び4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンとのダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物のF12（DMEM / F12）酸、N – （2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-N ' – （2-エタンスルホン酸）（HEPES）、10％FBS、0.5 / mlのアムホテリシンB、および100μg/ mLのゲンタマイシンを含有する（FUrther）はMESC媒体と呼ばれます。 脱落膜中に文化MESCへのフィルタリング2％のMESC培地の500ミリリットルを作る：フェノールレッド、L-グルタミンおよび2％FBS、0.5μgの/ mLのアムホテリシンBを含むHEPES、および100μg/ mLのゲンタマイシンを含むDMEM / F12。 さらに呼ばFBS 10％を含むDMEM、0.5μgの/ mLのアンホテリシンB、100μg/ mLのゲンタマイシン、25％MCDB-105培地、および5μg/ mLインスリン（：フィルタリングマウス子宮内膜上皮細胞の500ミリリットル（MEEC）培地を準備します）MEEC媒体として。 MESC培養用ポリ-L-リジン（PLL）コーティングされたカバースリップを準備します。 蒸留水250mLにPLL 25mgを溶解させます。 0.22μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。 12ウェルプレート中の滅菌カバースリップを追加します。カバーガラス上で溶解したPLLの300μLを追加します。 インキュベーションの30分後に溶液を除去。 （ – 2ヶ月まで1）プレートを4℃でさらに使用するまでに保存することができます。 10mg / mLストック溶液Oを準備-20℃でのfのコラゲナーゼタイプIAおよび300μLの店舗アリコート。使用前にフィルタします。 24時間単離する前に必要な3.準備 MEEC培養用のコラーゲンコートしたカバースリップを準備します。 蒸留水に0.02 M酢酸溶液（カバースリップあたり1 ml）を準備します。 50μg/ mLの最終濃度を得るために、0.02 M酢酸の12 mLの150μLのコラーゲンを追加します。 12ウェルプレート中の滅菌カバースリップを追加します。 （3.1.2を参照）コラーゲン溶液1mLを加えます。 37℃でO / N（最低12時間）インキュベートします。 分離時： （クリーンベンチ内で）無菌環境下で吸引によってカバースリップオフコラーゲン溶液を除去し、空気乾燥してみましょう。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回カバースリップを洗浄します。 10 mLを含む15 mLの標準的な管0.25グラムのパンクレアチンを添加することにより、2.5％のパンクレアチン溶液を調製HBSS +。溶解性を増加させるために1時間（200 rpm）で37℃で溶液を振ります。 4℃で保存。 マウスの子宮内膜上皮細胞（MEEC）とマウスの子宮内膜間質細胞（MESC）の4単離および培養 0.25％トリプシン（さらにMESC消化ミックスと呼ばれる）を含む最終的な解決策を終了する（3.2参照）2.5％パンクレアチン溶液を含む15 mLチューブにトリプシン25mgを追加します。 子宮の単離 膣スメア検査で動物の周期相を確認してください。 動物を拘束し、50μLのPBSで穏やかに3膣をフラッシュ – 5回。 スライドガラス上の最終的なフラッシュを収集します。 10倍または20倍対物レンズを使用して明視野顕微鏡下で材料を調べます。 唯一の発情期にあるマウスを使用します。この段階は、膣洗浄（ 図1中の角化上皮細胞の存在によって特徴付けられます</stronグラム>）。 このような頸椎脱臼またはCO 2誘発昏睡などの適切な方法を用いて、動物を安楽死させます。 無菌環境を生成するために、70％エタノールで死体をスプレーしてください。 無菌手術ツールを使用して、腹部を開き、両方の子宮角を可視化するために確保腸を押してください。 卵管の下の最も遠位端で子宮角をつかみます。卵管から子宮角を解剖し、脂肪および結合組織を除去します。子宮体以上の遠位端にホーンを切り出し、HBSS + 3mlで35ミリメートルペトリ皿に入れてください。 すべての子宮角が収集されるまで、他のホーン用や他の動物のために、この手順を繰り返します。 さらに、ステレオスコープの下で（HBSS +中）子宮角をきれいにし、すべての残留脂肪や結合組織を除去します。 子宮内腔を露出させ、目を置き換えるために、長手方向に開いた子宮角をカット新鮮なHBSS +で新しいペトリ皿の電子ホーン。 パンクレアチン及びトリプシンを含む15 mLのチューブに、すべての子宮角を転送します。 オービタルシェーカー（50回転）に4℃で60分間水平にインキュベートします。 振盪せずに、23℃（RT）で45分間水平にインキュベートします。 振盪せずに37℃（水浴）で15分間水平にインキュベートします。 一方、0.05％トリプシンエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の溶液2.7 mL中の1mg / mLのコラゲナーゼ株式の300μLを溶解させることによりMESC消化ミックスを作ります。 注：今すぐ上から、さらに単離段階はクリーンベンチの下で無菌環境で行われています。 マウスの子宮内膜上皮細胞（MEEC）文化 インキュベーションの2時間後、慎重に上澄み液を離れて注ぎます。 トリプシンを不活性化するために、コールドMEEC培地を含むペトリ皿に子宮に移し、5分間インキュベートアクティビティ。 冷HBSS +の3 mLを含む15 mLチューブに子宮を転送します。 上皮シートを解放するために10秒間ボルテックス。 3 mLのHBSS +できれいなペトリ皿に子宮をすすぎます。 繰り返しステップ4.3.2 – 4.3.4は、上皮シートを含む3つの懸濁液の合計を取得します。 MESC消化ミックスに子宮を移し、（200rpm）し振とうしながら37℃で30分間インキュベート（MESCのさらなる分離のために4.4に進みます）。 組織破片を除去するために、100μmのナイロンメッシュ上に静かに3つの細胞懸濁液をピペットで上皮シートを回復します。 5分間500×gで回収し、細胞懸濁液を遠心。 MEEC培地12 mL中にペレットを再懸濁し、よく混ぜます。 重力沈降を使用して残りMESCを分離するために5分間溶液を沈降。 5 mLのピペットを使用して慎重に上位2ミリリットルを削除します。 細胞サスペンシオを遠心nは5分間、500×gで。 優しく上下にピペッティングすることによりMEEC培地中で再懸濁します。 さらなる実験（ 図2a）のための所望の密度でコラーゲン被覆カバースリップ上の細胞をプレート。 最低12時間、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。 注：RNAまたはタンパク質の単離が望まれる場合に、6ウェルプレートに播種が推奨されている間、免疫染色や蛍光カルシウムイメージングなどの機能の実験のために、それは、カバースリップ上で直接細胞をプレーすることをお勧めします。マウス子宮内膜間質細胞の分離が不十分であることができる唯一の消化後に細胞の純度のような2回に分割されています。子宮は、最適な細胞回復および純度を二回消化されています。両方のラウンドでは技術的な介入は同一です。研究者が望むように、両方のラウンドから回収した細胞を、さらなる実験のために維持することができます。 マウスの子宮内膜のStrOMAL細胞（MESC）文化：第1ラウンドラウンド最初の消化を開始する前に、2.7mLの0.05％トリプシン-EDTA溶液中の1mg / mLのコラゲナーゼ株式の300μLを溶解することにより、第2の消化ミックスを準備します。このミックスはステップ4.4.8で必要とされます。 冷たい（4°C）のHBSS +とMESC培地3mlで3×15 mLチューブ（チューブX1、X2およびX3）と三つの小さなペトリ皿を準備します。 インキュベーションの30分後、10秒間穏やかに子宮を含有するトリプシン溶液を振ります。 MESC細胞が子宮組織から離脱し、トリプシン溶液中に残ります。 冷たい（4°C）のHBSS + 3 mLを含む最初のペトリ皿に子宮を移し、よくすすいでください。 トリプシン活性を阻害するために当初は（ステップ4.4.3でチューブ）子宮角を含むチューブにMESC培地の3ミリリットルを追加します。 HBSS + MESC培地の3ミリリットルを含むチューブX1に冷たい（4℃）でペトリ皿から子宮を移し、10秒間軽く振ります。 </li> 繰り返し二回4.4.4（冷（4℃）HBSS +でペトリ皿への転送）および4.4.6（チューブX2とX3への転送）を繰り返します。 注：最後に、このプロトコルは、4細胞懸濁液になります：1管がトリプシン溶液とMESCを含むMESC培地で3つの管（チューブのX1、X2およびX3）を含みます。 ステップ4.4.1で説明したように、新しいMESC消化で子宮を転送し、垂直方向に、37℃で30分間インキュベートします。 40μmのナイロンメッシュを通して4つの細胞懸濁液を渡すことで、間質細胞を収集します。 MESCの追加5mLでメッシュをすすぎます。 7分間500×gで細胞懸濁液を遠心します。 所望の密度とのさらなる実験のためにPLLコートしたカバーガラス上MESCとプレートにペレットを再懸濁。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で6時間またはO / N – 4の最小インキュベートします。 マウスの子宮内膜間質細胞（MESC）文化：第2ラウンド <オール> 冷たい（4°C）のHBSS +とMESC培地3mlで3×15 mLチューブ（チューブY1、Y2およびY3）と三つの小さなペトリ皿を準備します。 4.4.7 – を繰り返して、4.4.3を繰り返します。 40μmのナイロンメッシュに子宮と一緒に最後の細胞懸濁液を転送します。 ナイロンメッシュを通してチューブY1、Y2及びY3のコンテンツを渡すことで、間質細胞を収集します。 MESCの追加5mLでメッシュをすすぎます。 7分間500×gで細胞懸濁液を遠心します。 さらなる実験（ 図2b）のためのPLLでコーティングされたカバースリップ上MESC媒体とプレートでペレットを再懸濁。 5％CO 2、37℃で6時間- 4の最小インキュベートします。 注：RNAまたはタンパク質の単離が望まれる場合に推奨される6ウェルプレートに播種しながら、免疫染色や蛍光カルシウムイメージングなどの機能の実験のために、それは、カバースリップ上の細胞をプレーすることをお勧めします。 5.ビメンチンピュアMEECとMESC文化の検証のための/サイトケラチン二重染色カバースリップ上の細胞をシード。 PBSは、オービタルシェーカー（50回転）にカルシウムとマグネシウムを含有する3×5分間洗浄します。 ないシェーカー上で、10分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）（ 注意！）で細胞を固定してください。 シェーカー（50回転）にカルシウムとマグネシウムを含まないPBSで3回洗浄します。 シェーカー（50 RPM）で10分間、0.2％トリトンX-100で細胞を透過性。 シェーカー上でPBSで3回洗浄します。 シェーカー上で2時間（50 RPM）をPBS中5％ヤギ血清（GS）を有するブロックシェーカー（50回転）に4℃で（：1：500）およびモノクローナルマウス抗ヒトパンサイトケラチン（千1）モノクローナルウサギ抗ヒトビメンチンで細胞をインキュベートします。抗体は、0.5％GSでPBSで希釈します。 シェーカー上でPBSで洗浄3回（50回転）。 二次抗体を用いて細胞をインキュベート（1：1,000を0.5％GSで）アレクサフルオロ488結合抗ウサギIgGおよびAlexaフルーア488 conjuシェーカー上で抗マウスIgGをゲーティング。 シェーカー上でPBSで3回洗浄します。 マウントは、DAPI、ドライO / Nを含有する水性マウンティング培地で摺動します。 マニキュアでスライドを密封し、さらなる使用のために4℃に保つ（ 図2a、b）に 。 共培養システムにおけるインビトロ脱落膜化6. 注：4〜5匹の動物を、24ウェルプレートで共培養システムを確立するために必要とされます。好ましくはクリーンベンチの下で、無菌環境で、以下のプロトコルを続行します。 調製した細胞培養物は、付加的な24ウェルプレートにおいて（4.3を参照）、上皮細胞単離の遠心分離および/またはインキュベーション工程の間に挿入します。 24ウェルプレート中のウェルの所望の量にMESC媒体の400μL – 200を追加します。 滅菌ピンセットを用いて、プレフィルド24ウェルに挿入を置きます。 MEECペレットを再懸濁インサートの上MEEC中・デバイド（ステップ4.3.14）（作業容量：150 – インサートあたり300μL）。文化、5％CO 2インキュベーター内で37℃で細胞。 間質細胞の単離（ステップ4.5.6）の第二ラウンドの後に（細胞培養インサートと互換性の）別の24ウェルプレート中の間質細胞をシード。ウェルあたり400μLの細胞懸濁液の作業容量を使用します。 5％CO 2インキュベーター中で37℃で6時間-間質細胞は、最小4のためにアタッチすることができます。 間質細胞で覆われた第二の24ウェルプレートに最初の24ウェルプレートからの上皮細胞で覆われた細胞培養インサートを移します。滅菌ピンセットを使用するかだけその吊りふもとにインサートをタッチします。 培養3の期間、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞- 5 D上皮細胞は単層を形成し、間質細胞は、80を達成するまで、 – 90％のコンフルエンシーに。さらに、経上皮電気抵抗（TEER）を使用グラントらによって記載されるようにボルト/オーム上皮メーターを用いて、上皮単層を監視します。 7。 800〜/ウェルの値は、上皮単層コンフルエントを検討するのに十分でした。 ガラスピペットまたはファインピペットチップを使用して3日 – 必要に応じて、すべての2培地を交換してください。インサート媒体を交換する前に、（下で播種）間質細胞の培地を交換して起動します。これを37℃に予熱した細胞培養培地を使用することをお勧めします。 実験を開始する前に、 試験管脱落膜に誘導するために脱落膜化媒体を準備します。間質細胞のウェルあたり400μLの作業容量を使用してください。 -20℃で、以下のストック溶液とストアのアリコートを準備します。 エタノール中に250μMのメドロキシプロゲステロン17-アセテート（MPA）を準備します。 100mMのストック溶液8ブロモアデノシン3 '、5'-超純水でキャンプを準備します。 1μMのMPAおよび2％FBSを含むMESC培地中の0.5mMのcAMPを含む脱落膜の媒体を作ります。 ゆっくりウェルから培地を除去し、間質細​​胞上に脱落膜培地を追加します。制御条件が必要な場合は、2％のFBSを含有するMESC媒体を用います。 細胞培養インサートから培地を除去し、細胞上にMEEC媒体の300μLを追加します。 5％のCO 2で37℃のインキュベーターで5日間細胞をインキュベートします。 五日後、RT-qPCRにより間質細胞における脱落膜化の程度を評価（下記参照）。 レサズリンベースの生存能力の試薬を用いて、上皮細胞の生存性を検証します。 MEEC培地中で生存可能性試薬の1:10溶液を調製します。 新しい24ウェルプレートに細胞培養インサートを転送します。 細胞上にMEECソリューション – 生存性試薬の300μL – 150を追加します。 で5％CO 2中37℃でインキュベート少なくとも4から5時間または一晩（パープル/ピンク青）カラーシフトを観察することによって、細胞の生存率を評価します。 注：研究者によって好ましいと脱落膜化はまた、マウスプロラクチン特異的ELISAを用いて評価することができます。 定量RT-PCRによる脱落膜化の7.Validation 注：定量RT-PCRによる脱落膜化の検証のためには、RNA分析のために細胞の十分な量を受け取るために二重にすべてのテスト条件を実行することをお勧めします。 デClercq らに以前に記載されているように、定量的RT-PCRが行われます。 8。 簡単に説明します： 商業RNA単離キットを用いて全RNAを単離します。 それぞれ、製造業者のプロトコルに従って、商業用の方法を用いてRNAの量と質を評価します。 1μgの全RNAから出発し、製造業者のプロトコルに従って、cDNAを合成。 QRT-PCR反応を行うために、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを使用します。 三連ですべてのサンプルを実行します。 反応を実施することが望まハウスキーピング遺伝子とプロラクチン（prl8a2）用の市販のTaqManマスターミックスおよび特定のTaqManプローブを使用してください。