Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em> In Vitro</em> decidualization

AlexaFluor Alle Tierversuche für diese Studie wurden von der Ethikkommission der KU Leuven (Belgien) (Projekt P174 / 2013) genehmigt. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen untergebracht ist , mit ad libitum Zugang zu Futter – Pellets und Leitungswasser und hielt unter kontrollierten Bedingungen (23 ± 1,5 ° C, relative Luftfeuchtigkeit 40 – 60%, 12/12 Hell / Dunkel – Zyklus). 1. Mäuse Verwenden Sie handelsübliche Mausstamm (dh C57Bl / 6, weiblich 8 bis 12 Wochen alt). Typischerweise 4 bis 5 Mäusen werden eine geeignete Menge an Zellen für weitere Experimente ergeben. Injizieren intakten Mäusen subkutan mit 100 & mgr; l des 17β-Östradiol (E2) Lösung (100 ng / 100 & mgr; l) für 3 aufeinanderfolgende d vor der Isolation, um die Phase des Östrus-Zyklus der Tiere zu standardisieren und die Proliferation des Endometriums zu induzieren Zellen. Die Notwendigkeit für die Zyklusphase der Mäuse überprüft, bevor das Protokoll beginnt, ist vermeidbarUrsache für die 3 d 'Östradiolbehandlung. 2. Vorbereitungen Machen Sie eine Lösung von 100 ng / 100 & mgr; l E2 in Erdnußöl. Für die Injektionen von fünf Mäusen (wie in 1.2 beschrieben), eine Menge von 1,5 ml benötigt. Man löst 1 mg E2 in 1 mL Ethanol eine Stammlösung von 1 mg haben / mL. Verdünnen dieser Stammlösung 1: 1000 in Arachisöl. Machen 500 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBBS) 1x ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (weiter bezeichnet als HBSS +). Machen 500 ml gefiltertes Maus Endometrial Stromal Cell (MESC) Medium zur Kultur MESC: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) mit Phenolrot, L-Glutamin und 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure Säure, N – (2-hydroxyethyl) Piperazin- N '- (2-ethansulfonsäure) (HEPES) , enthaltend 10% FBS, 0,5 ug / ml Amphotericin B und 100 & mgr; g / mL Gentamicin (fueitere bezeichnet als MESC Medium). Machen 500 ml gefiltertes 2% MESC Medium zur Kultur MESC während Dezidualisierung: DMEM / F12 mit Phenolrot, L-Glutamin und HEPES, enthaltend 2% FBS, 0,5 ug / ml Amphotericin B und 100 & mgr; g / mL Gentamicin. Bereiten 500 ml gefiltertes Maus Endometrial Epithelial Zelle (MEEC) Medium: DMEM mit 10% FBS, 0,5 ug / ml Amphotericin B, 100 ug / ml Gentamicin, 25% MCDB-105-Medium, und 5 ug / ml Insulin (weiter bezeichnet als MEEC Medium). Bereiten Poly-L-lysin (PLL) beschichtete Deckgläser für MESC Kultur. Man löst 25 mg des PLL in 250 ml destilliertem Wasser. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 um-Filter. In sterilen Deckgläschen in einer 12-Well-Platte. In 300 & mgr; l gelösten PLL auf den Deckgläsern. Entfernen Sie die Lösung nach 30 Minuten Inkubation. Die Platten können bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden (bis zu 1 bis 2 Monate). Bereiten Sie eine 10 mg / ml Stammlösung of Kollagenase Typ IA und speichern Aliquots von 300 & mgr; l bei -20 ° C. Filter vor dem Gebrauch. 3. Vorbereitung Erforderliche 24 h vor der Isolation Bereiten Sie Kollagen beschichtete Deckgläser für MEEC Kultur. Bereiten Sie eine 0,02 M Essigsäurelösung in destilliertem Wasser (1 ml pro Deckglas). Zugabe von 150 & mgr; l-Kollagen in 12 ml 0,02 M Essigsäure in einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erhalten. In sterilen Deckgläschen in einer 12-Well-Platte. 1 ml der Kollagenlösung (siehe 3.1.2). Inkubieren O / N (mindestens 12 h) bei 37 ° C. Bei der Isolierung: Entfernen Sie die Kollagenlösung aus den Deckgläsern durch Absaugen und lassen Sie es an der Luft trocknen in einer sterilen Umgebung (in der Laminar-Flow-Gehäuse). Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Vorbereiten eines 2,5% Pankreatin-Lösung durch Zugabe von 0,25 g Pankreatin in einem 15 ml Röhrchen mit canonical 10 mlHBSS +. Schütteln (200 rpm) wurde die Lösung bei 37 ° C für 1 h, die Löslichkeit zu erhöhen. Lagerung bei 4 ° C. 4. Isolierung und Kultur von Maus Endometrial Epithelial Cells (MEEC) und Maus Endometrial Stromazellen (MESC) In 25 mg Trypsin in einem 15 ml-Röhrchen mit 2,5% Pankreatin-Lösung (siehe 3.2) mit einer endgültigen Lösung, um am Ende mit 0,25% Trypsin (weiter bezeichnet als MESC Verdauung mix). Isolierung von Uteri Überprüfen Sie die Zyklusphase der Tiere mit einem Scheidenabstrich Prüfung. Begrenze die Tier und spülen Sie die Vagina vorsichtig mit 50 & mgr; l PBS 3-5 mal. Sammeln Sie die letzte Flush auf einem Glasträger. Untersuchen Sie das Material unter einem Hellfeld-Mikroskop ein 10X oder 20X Ziel verwenden. Verwenden Sie nur Mäuse, die in der Brunst Phase sind. Diese Stufe wird durch die Anwesenheit von verhornten Epithelzellen in der vaginalen Lavage (Abbildung 1 , dadurch gekennzeichnet </strong>). Euthanize die Tiere eine geeignete Methode wie Genickbruch oder CO 2 -induzierte Narkose verwendet wird . Sprühen der Karkassen mit 70% Ethanol, um eine sterile Umgebung zu erzeugen. Mit einer sterilen chirurgischen Werkzeugen, öffnen Sie den Bauch und den Darm zur Seite schieben beide Uterushörner zu visualisieren. Besorgen Sie sich die Uterushorn am meisten distalen Ende unter den Eileiter. Präparieren Sie die Gebärmutterhörner von Eileiter und entfernen Fett- und Bindegewebe. Schneiden Sie das Horn am distalen Ende über dem Uteruskörper heraus und legen Sie sie in einer 35 mm Petrischale mit 3 ml HBSS +. Wiederholen Sie diesen Schritt für das andere Horn und für die anderen Tiere, bis alle Gebärmutterhörner gesammelt werden. Reinigen Sie das Uterushorn (in HBSS +) weiter unter einem Stereoskop und entfernen Sie alle Rest Fettgewebe oder Bindegewebe. Schneiden Sie die Gebärmutterhörner offen längs der Uteruslumen zu entlarven und ersetzen the Horn in einem neuen Petrischale mit frischem HBSS +. Übertragen Sie alle Gebärmutterhörner an den 15 ml-Röhrchen mit Pankreatin und Trypsin. Inkubieren horizontal für 60 min bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler (50 rpm). Inkubieren horizontal für 45 min bei 23 ° C (RT), ohne Schütteln. Inkubieren horizontal für 15 min bei 37 ° C (Wasserbad), ohne Schütteln. machen den MESC Verdauung Mix mittlerweile von 300 & mgr; l der 1 mg / ml Kollagenase Lager in 2,7 ml 0,05% Trypsin-(EDTA) -Lösung gelöst wird. HINWEIS: Von nun an weitere Isolierungsschritte werden in einer sterilen Umgebung unter einer Laminar-Flow-Box durchgeführt. Maus Endometrial Epithelzellen (MEEC) Kultur Nach 2 Stunden Inkubation, abgießen den Überstand vorsichtig Lösung. Übertragen Sie die Uteri in eine Petrischale kalt MEEC Medium enthält, und Inkubation für 5 min, um Trypsin zu inaktivierenAktivität. Übertragen die Uteri in ein 15 ml Röhrchen mit 3 ml kaltem HBSS +. Vortex für 10 s, die epithelialen Blätter zu lösen. Spülen Sie die Uteri in einer sauberen Petrischale mit 3 ml HBSS +. Wiederholen Sie Schritt 4.3.2 – 4.3.4 insgesamt drei Suspensionen, die Epithelschichten zu erhalten. Übertragen Sie die Uteri auf den MESC Verdauung Mischung und Inkubation bei 37 ° C für 30 min unter Schütteln (200 rpm) (go 4.4 für die weitere Isolierung von MESC zu Schritt). Recover die Epithellagen durch Pipettieren der drei Zellsuspensionen sanft auf einem 100 & mgr; m Nylon-Mesh-Gewebe, um Schmutz zu entfernen. Zentrifugieren Sie die gesammelte Zellsuspension bei 500 g für 5 min. Das Pellet in 12 ml MEEC Medium und gut mischen. Vereinbaren Sie die Lösung für 5 Minuten, um verbleibende MESC mit Schwerkraftsedimentation zu trennen. Entfernen Sie vorsichtig die oberen 2 ml durch eine 5 ml Pipette. Zentrifugieren Sie die Zelle suspension bei 500 xg für 5 min. Resuspendieren in MEEC Medium durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten. Platte die Zellen auf Kollagen-beschichtete Deckgläser in die gewünschte Dichte für weitere Experimente (Abbildung 2a). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für mindestens 12 h. HINWEIS: Für die Immunfärbung oder funktionelle Experimente wie fluoreszierende Kalzium-Imaging, ist es ratsam, die Zellen direkt auf die Deckgläser an der Platte, während sie in einer 6-Well-Platte Impfen wird empfohlen, wenn RNA oder Proteinisolierung erwünscht ist. Isolation of endometrial stromal Zellen der Maus wird nach kann unzureichend sein, nur eine Verdauung als die Reinheit der Zellen in zwei Runden unterteilt. Die Uteri werden zweimal für eine optimale Zellrückgewinnung und Reinheit verdaut. In beiden Runden sind die technischen Eingriffe identisch. Zellen aus beiden Durchgängen gesammelt kann für weitere Versuche aufbewahrt werden, wie durch den Forscher gewünscht. Maus Endometrial Stromal Zelle (MESC) Kultur: 1. Runde Vor dem Start der ersten Runde der Verdauung, bereiten eine zweite Verdauung Mischung durch Auflösen von 300 & mgr; l der 1 mg / ml Kollagenase Lager in 2,7 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung. Diese Mischung wird in dem Schritt 4.4.8 benötigt. Bereiten drei kleine Petrischalen mit kaltem (4 ° C) HBSS + 3 x 15 ml-Röhrchen mit 3 ml MESC Medium (tube X1, X2 und X3). Nach 30 Minuten Inkubation, schütteln Sie die Uteri haltigen Trypsinlösung sanft für 10 s. MESC Zellen werden aus der Gebärmuttergewebe abzulösen und werden in der Trypsin-Lösung bleiben. Übertragen Sie die Uteri auf die erste Petrischale mit 3 ml kaltem (4 ° C) HBSS + und gut ausspülen. 3 ml MESC Medium zum Rohr ursprünglich die Uterushörner (tube in Schritt 4.4.3), die Trypsin-Aktivität zu inhibieren. Übertragen Sie die Uteri aus der Petrischale mit kaltem (4 ° C) HBSS + zu Rohr X1, das 3 ml MESC Medium und leicht schütteln für 10 s. </li> Wiederholen Sie die Schritte 4.4.4 (Übertragung in eine Petrischale mit kaltem (4 ° C) HBSS +) und 4.4.6 (Übertragung auf Rohr X2 und X3) zweimal. HINWEIS: Schließlich ist dieses Protokoll wird in 4 Zellsuspensionen ergeben: eine Röhre, die Trypsin-Lösung und 3 Röhrchen mit MESC Medium, das MESC (Rohre X1, X2 und X3) enthält. Übertragen uteri in der neuen MESC Verdauung, wie in 4.4.1 beschriebenen Schritt und Inkubation für 30 min bei 37 ° C, in vertikaler Richtung. Sammeln Sie die Stromazellen durch die vier Zellsuspensionen durch ein 40 & mgr; m Nylon-Mesh vorbei. Spülen Sie das Gitter mit zusätzlichen 5 ml MESC. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 g für 7 min. Das Pellet in MESC und Platte auf PLL-beschichtete Deckgläser für weitere Experimente mit der gewünschten Dichte. Inkubieren für mindestens 4 bis 6 h oder O / N bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Maus Endometrial Stromatumoren Zelle (MESC) Kultur: 2. Runde <ol> Bereiten drei kleine Petrischalen mit kaltem (4 ° C) HBSS + 3 x 15 ml-Röhrchen mit 3 ml MESC Medium (Tubes Y1, Y2 und Y3). Wiederholen Sie die Schritte 4.4.3 – 4.4.7. Übertragen Sie die letzte Zellsuspension zusammen mit dem Uteri auf einen 40 & mgr; m Nylon-Mesh. Sammle die Stromazellen durch den Inhalt des Röhrchens Y1 vorbei, Y2 und Y3 durch das Nylonnetz. Spülen Sie das Gitter mit zusätzlichen 5 ml MESC. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 g für 7 min. Resuspendieren des Pellets in MESC Medium und Platte auf PLL-beschichtete Deckgläser für weitere Experimente (Abbildung 2b). Inkubieren für mindestens 4 bis 6 h bei 37 ° C mit 5% CO 2. HINWEIS: Für die Immunfärbung oder funktionelle Experimente wie fluoreszierende Kalzium-Imaging, ist es ratsam, die Zellen auf Deckgläser an der Platte, während sie in einer 6-Well-Platte Impfen wird empfohlen, wenn RNA oder Proteinisolierung erwünscht ist. 5. Vimentin/ Cytokeratin Doppelfärbung für die Validierung der reinen MEEC und MESC Kulturen Seed die Zellen auf Deckgläsern. Waschen 3 x 5 min mit PBS, das Calcium und Magnesium auf einem Orbitalschüttler (50 rpm). Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) (ACHTUNG!) Für 10 min, nicht auf einem Schüttler. Waschen Sie 3x mit PBS ohne Calcium und Magnesium auf einem Schüttler (50 rpm). Permeabilisierung der Zellen mit 0,2% Triton X-100 für 10 min auf einem Schüttler (50 rpm). Waschen Sie 3x mit PBS auf einem Schüttler. Block mit 5% Ziegenserum (GS) in PBS für 2 Stunden auf einem Schüttler (50 Umdrehungen pro Minute) Inkubiere Zellen mit monoklonalem Kaninchen-Anti-Human-Vimentin (1: 500) und monoklonalen Maus-anti-human Panzytokeratin (1: 1000) bei 4 ° C auf einem Schütteltisch (50 rpm). Antikörper werden in PBS mit 0,5% GS verdünnt. Waschen 3x mit PBS auf einem Schüttler (50 rpm). Inkubiere Zellen mit Sekundärantikörper (1: 1000 in 0,5% GS) Alexa Fluor 488-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 488-conjugated anti-Maus-IgG auf einem Schüttler. Waschen Sie 3x mit PBS auf einem Schüttler. Berg Träger mit wässrigen Eindeckmedium enthält DAPI und trocken O / N. Verschließen Sie die Dias mit Nagellack und halten auf 4 ° C zur weiteren Verwendung (Abbildung 2a, b). 6. In – vitro – decidualization in einer Cokultur – System HINWEIS: Vier bis fünf Tiere sind verpflichtet, eine Co-Kultur-System in einer 24-Well-Platte zu schaffen. Weiterhin mit dem folgenden Protokoll in einer sterilen Umgebung, vorzugsweise unter einer laminaren Strömungsgehäuse. Bereiten Sie die Zellkultur-Einsätze während der Zentrifugation und / oder Inkubationsschritte der epithelialen Zellisolierung in einem zusätzlichen 24-Well-Platte (wie in 4.3 beschrieben). Hinzufügen 200-400 uL MESC Medium in der gewünschten Menge von Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen. Legen Sie die Einsätze in den prefilled 24-Mulden mit einer sterilen Zange. Resuspendieren MEEC Pellet(Schritt 4.3.14) in MEEC Medium und teilen sich über die Einsätze (Arbeitsvolumen: 150 – 300 ul pro Einsatz). Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Seed die Stromazellen in einem anderen 24-Well-Platte (kompatibel mit den Zellkultur-Einsätze) nach der zweiten Runde der Stroma-Zellisolierung (Schritt 4.5.6). Verwenden Sie ein Arbeitsvolumen von 400 & mgr; l Zellsuspension pro Vertiefung. Ermöglichen die Stromazellen für mindestens 4 zu befestigen – 6 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Transfer der Zellkultur-Einsätze mit Epithelzellen aus dem ersten 24-Well-Platte in die zweite Platte mit 24 Vertiefungen durch Stromazellen bedeckt. Verwenden Sie sterilisierten Pinzette oder die Einsätze berühren nur an ihren hängenden Fuß. Kultur die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator für einen Zeitraum von 3 bis 5 d , bis die Epithelzellen bilden eine einlagige und die Stromazellen erreichen 80 bis 90% Konfluenz. Darüber hinaus verwenden die transepitheliale elektrische Widerstand (TEER)die epitheliale Monoschicht durch Verwendung einer Volt / Ohm – Meter epithelial zu überwachen , wie von Grant et al. 7. Werte von 800-1.000 / gut waren ausreichend, um die epitheliale Monoschicht konfluent zu betrachten. Bei Bedarf ersetzen Sie das Medium alle 2 – 3 d unter Verwendung von Glaspipetten oder feinen Pipettenspitzen. Beginnen mit dem Austausch des Mediums der Stromazellen (am Boden ausgesät), bevor das Medium in den Einsätzen zu ersetzen. Es wird empfohlen, bei 37 ° C vorgewärmten Zellkulturmedium zu verwenden. Bereiten Sie die decidualization Medium in vitro decidualization einzuleiten , bevor das Experiment beginnt. Verwenden Sie ein Arbeitsvolumen von 400 & mgr; l pro Vertiefung von Stromazellen. Die folgenden Stammlösungen und speichern Aliquots bei -20 ° C. Bereiten 250 uM Medroxyprogesteron 17-acetat (MPA) in Ethanol. Bereiten 100 mM Stammlösung 8-Bromadenosin 3 ', 5' cAMP in Reinstwasser. Machen Sie das dezidualen Medium mit 1 uM MPA und 0,5 mM cAMP in MESC Medium mit 2% FBS. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie das dezidualen Medium auf die Stromazellen. Wenn ein Steuerzustand benötigt wird, verwenden Sie das MESC Medium mit 2% FBS. Entfernen des Mediums aus der Zellkultureinsätze und 300 & mgr; l MEEC Medium auf die Zellen. Inkubiere die Zellen 5 d in einem Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2. Nach dem fünften Tag, um das Ausmaß der Dezidualisierung in stromalen Zellen durch RT-qPCR bewerten (siehe unten). Bestätigen Sie die Lebensfähigkeit der Epithelzellen der Resazurin-basierten Lebensfähigkeit Reagenz. Bereiten Sie eine Lösung von 01.10 Lebensfähigkeit Reagens in MEEC Medium. Übertragen Sie die Zellkultur-Einsätze in eine neue 24-Well-Platte. In 150 bis 300 & mgr; l der Lebensfähigkeit Reagenz – MEEC Lösung auf die Zellen. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für zuminmindestens 4 – 5 h oder über Nacht und die Lebensfähigkeit der Zellen beurteilen durch eine Farbverschiebung (blau bis violett / pink) zu beobachten. HINWEIS: Dezidualisierung auch bewertet werden kann, eine Maus Prolaktin-spezifischen ELISA verwendet, wie durch den Forscher bevorzugt. 7.Validation von decidualization durch qRT-PCR HINWEIS: Für die Validierung des decidualization durch qRT-PCR, wird empfohlen, alle Testbedingungen in doppelter Ausführung durchzuführen, um eine ausreichende Menge an Zellen für die RNA-Analyse zu erhalten. Quantitative RT-PCR wird vorher in De Clercq et al beschrieben durchgeführt. 8. In Kürze: Isolieren Sie die Gesamt-RNA Kommerzielle RNA Isolation Kit. Beurteilen Sie die Quantität und Qualität der RNA unter Verwendung handelsüblicher Methoden gemäß dem Protokoll des Herstellers sind. Synthetisieren cDNA gemäß Herstellerprotokoll von 1 ug Gesamt-RNA starten. Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Kits dem Protokoll des Herstellers nach der qRT-PCR-Reaktion durchzuführen. Führen Sie alle Proben in dreifacher Ausfertigung. Nutzen Sie die kommerziellen TaqMan Master Mix und spezifischen TaqMan-Sonden für die gewünschten Housekeeping-Gene und Prolaktin (prl8a2), ​​um die Reaktion durchzuführen.