Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de<em> In Vitro</em> decidualization

AlexaFluor Todos los experimentos con animales para este estudio fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad Católica de Lovaina (Bélgica) (Proyecto P174 / 2013). Los ratones se alojaron en condiciones estándar, con acceso ad libitum a bolitas de comida y agua del grifo, y se mantuvieron en condiciones controladas (23 ± 1,5 ° C, humedad relativa 40 – 60%, 12/12 ciclo de luz / oscuridad). 1. Los ratones Utilizar como cepa de ratón comercialmente disponible (es decir, C57BL / 6, hembra 8 – 12 semanas de edad). Típicamente, 4 – 5 ratones producirán una cantidad adecuada de células para experimentos adicionales. Inyectar ratones intactos por vía subcutánea con 100 l de la 17β-estradiol (E2) solución (100 ng / 100 l) para 3 consecutivo d antes de la aislamiento con el fin de estandarizar la fase del ciclo estral de los animales y para inducir la proliferación de endometrio Células. La necesidad para el control de la fase del ciclo de los ratones antes de iniciar el protocolo es ser evitablecausa de la 3 d 'tratamiento con estradiol. 2. Preparativos Hacer una solución de 100 ng / 100 l E2 en aceite de cacahuete. Para las inyecciones de cinco ratones (como se describe en 1.2), se necesita una cantidad de 1,5 ml. Disolver 1 mg E2 en 1 ml de etanol para tener una solución madre de 1 mg / mL. Diluir esta solución madre 1: 1.000 en aceite de cacahuete. Hacer 500 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBBS) 1x complementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (en lo sucesivo como HBSS +). Hacer 500 ml de filtrado de células de ratón endometrial del estroma (MESC) de medio a MESC cultura: de Eagle modificado por Dulbecco / Mezcla Nutriente F12 (DMEM / F12) con rojo fenol, L-glutamina y ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico ácido, N – (2-hidroxietil) piperazina N '- (ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), que contiene 10% de FBS, 0,5 mg / ml de anfotericina B, y 100 mg / ml de gentamicina (further refiere como medio MESC). Hacer 500 ml de filtrado medio MESC 2% a la cultura MESC durante decidualization: DMEM / F12 con rojo fenol, L-glutamina y HEPES que contiene 2% de FBS, 0,5 mg / ml de anfotericina B, y 100 mg / ml de gentamicina. Preparar 500 ml de filtrado de células de ratón Endometrial epitelial (MEEC) medio: DMEM que contiene 10% de FBS, 0,5 mg / ml de anfotericina B, 100 mg / ml de gentamicina, 25% MCDB-105 medio, y 5 mg / ml de insulina (en lo más a como medio MEEC). Preparar cubreobjetos de poli-L-lisina (PLL) recubiertos para la cultura MESC. Disolver 25 mg de PLL en 250 ml de agua destilada. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 micras. Añadir cubreobjetos estériles en una placa de 12 pocillos. Añadir 300 l de PLL disuelto en los cubreobjetos. Retire la solución después de 30 min de incubación. Las placas se pueden almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior (hasta 1 – 2 meses). Preparar a 10 mg / ml solución madre of colagenasa de tipo IA y almacenar alícuotas de 300 l a -20 ° C. Filtro antes de su uso. 3. Los preparativos necesarios antes de las 24 h Aislamiento Preparar cubreobjetos recubiertos de colágeno para la cultura MEEC. Preparar una solución de ácido acético 0,02 M en agua destilada (1 ml por cubreobjetos). Añadir 150 ml de colágeno en 12 ml de ácido acético 0,02 M para obtener una concentración final de 50 mg / ml. Añadir cubreobjetos estériles en una placa de 12 pocillos. Añadir 1 ml de la solución de colágeno (véase 3.1.2). Incubar O / N (mínimo 12 h) a 37 ° C. Durante el aislamiento: Eliminar la solución de colágeno de los cubreobjetos por succión y se deja secar al aire en un ambiente estéril (en la cabina de flujo laminar). Lavar los cubreobjetos dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Preparar una solución de pancreatina 2,5% mediante la adición de 0,25 g de pancreatina en un tubo de 15 ml que contenía canónica 10 ml deHBSS +. Agitar (200 rpm) de la solución a 37 ° C durante 1 h para aumentar la solubilidad. Almacenar a 4 ° C. 4. Aislamiento y cultivo de células epiteliales del endometrio de ratón (MEEC) y ratón endometrial células estromales (MESC) Se añaden 25 mg de tripsina en un tubo de 15 ml que contenía solución de pancreatina 2,5% (véase el punto 3.2) para terminar con una solución final que contenía 0,25% de tripsina (en lo sucesivo como MESC combinación de la digestión). Aislamiento de úteros Compruebe la fase del ciclo de los animales con un examen de frotis vaginal. Sujeción del animal y lavar la vagina con cuidado con 50 l de PBS 3 – 5 veces. Recoger el ras final sobre un portaobjetos de vidrio. Examinar el material bajo un microscopio de campo claro utilizando un objetivo 10X o 20X. Utilice sólo los ratones que son en la fase de estro. Esta etapa se caracteriza por la presencia de células epiteliales cornificadas en el lavado vaginal (Figura 1 </strong>). La eutanasia a los animales utilizando un método apropiado, como dislocación cervical o CO 2 narcosis inducida. Pulverizar los canales con 70% de etanol con el fin de generar un ambiente estéril. El uso de instrumentos quirúrgicos estériles, abrir el abdomen y los intestinos empujar a un lado para visualizar ambos cuernos uterinos. Coge el cuerno uterino en el extremo más distal bajo la trompa de Falopio. Diseccionar los cuernos uterinos de la trompa de Falopio y eliminar el tejido adiposo y conectivo. Cortar el cuerno en el extremo distal por encima del cuerpo del útero y colocarlo en una placa de Petri de 35 mm con 3 ml de HBSS +. Repita este paso para el otro cuerno y para los demás animales hasta que se recogen todos los cuernos uterinos. Limpiar el cuerno uterino (en HBSS +) adicionalmente bajo un estereoscopio y eliminar todo adiposo residual o tejido conectivo. Cortar los cuernos uterinos abiertos longitudinalmente para exponer el lumen uterino y reemplazar THe cuerno en una nueva placa de Petri con HBSS + fresca. Transferir todos los cuernos uterinos en el tubo de 15 ml que contiene pancreatina y tripsina. Incubar horizontalmente durante 60 minutos a 4 ° C en un agitador orbital (50 rpm). Incubar en posición horizontal durante 45 minutos a 23 ° C (temperatura ambiente), sin agitación. Incubar en posición horizontal durante 15 minutos a 37 ° C (baño de agua), sin agitación. Mientras tanto hacer la mezcla de digestión MESC disolviendo 300 l de la 1 mg / ml de colagenasa de valores en 2,7 ml de solución 0,05% de ácido Tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA). NOTA: A partir de ahora, más etapas de aislamiento se llevan a cabo en un ambiente estéril bajo una campana de flujo laminar. Ratón de células epiteliales del endometrio (MEEC) Cultura Después de 2 h de incubación, se vierte con cuidado la solución sobrenadante. Transferir los úteros en una placa de Petri que contiene medio de MEEC frío y se incuba durante 5 min para inactivar la tripsinaactividad. Transferir los úteros a un tubo de 15 ml que contiene 3 ml de HBSS frío +. Vortex durante 10 s para liberar las láminas epiteliales. Enjuague los úteros en una placa de Petri limpia con 3 ml de HBSS +. Repita el paso 4.3.2 – 4.3.4 para obtener un total de tres suspensiones que contienen láminas epiteliales. Transferir los úteros a la mezcla de digestión MESC e incubar durante 30 minutos a 37 ° C con agitación (200 rpm) (vaya al paso 4.4 para un mayor aislamiento de MESC). Recuperar las láminas epiteliales pipeteando las tres suspensiones de células suavemente en una malla de nylon 100 micras con el fin de eliminar los restos de tejido. Centrifugar la suspensión celular recogida a 500 xg durante 5 min. Resuspender el precipitado en 12 ml de medio MEEC y mezclar bien. Settle la solución durante 5 min con el fin de separar MESC restante mediante sedimentación por gravedad. Retire cuidadosamente los 2 ml superiores mediante el uso de una pipeta de 5 ml. Centrifugar la suspensio celularn a 500 xg durante 5 min. Volver a suspender en medio MEEC pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Placa de las células en cubreobjetos recubiertos de colágeno en la densidad deseada para experimentos adicionales (Figura 2A). Se incuban las células a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% durante un mínimo de 12 h. NOTA: Para la inmunotinción o experimentos funcionales como imágenes de calcio fluorescente, se aconseja la placa de las células directamente sobre el cubreobjetos, mientras que la siembra en una placa de 6 pocillos se recomienda cuando se desea el aislamiento de ARN o proteína. Aislamiento de células del estroma endometrial ratón se divide en dos rondas como la pureza de las células después de sólo una digestión puede ser insuficiente. Los úteros se digieren dos veces para una recuperación óptima de la célula y la pureza. En las dos vueltas de las intervenciones técnicas son idénticas. Las células recogidas de ambas rondas se pueden mantener para experimentos adicionales, según lo deseado por el investigador. Ratón endometrial StrCell omal (MESC) Cultura: 1ª Ronda Antes del inicio de la primera ronda de la digestión, preparar una segunda mezcla de digestión mediante la disolución de 300 l de 1 mg / ml de colagenasa de valores de 2,7 solución de tripsina-EDTA ml 0,05%. Se necesita esta mezcla en el paso 4.4.8. Preparar tres pequeñas placas de Petri de frío (4 ° C) HBSS + y 3 x 15 ml tubos con 3 ml de medio MESC (X1 tubo, X2 y X3). Después de 30 minutos de incubación, agite la solución que contiene tripsina-úteros suavemente durante 10 s. células MESC se separará del tejido uterino y permanecerán en la solución de tripsina. Transferir los úteros a la primera placa de Petri que contiene 3 ml de frío (4 ° C) HBSS + y enjuagar muy bien. Añadir 3 ml de medio MESC al tubo que contiene originalmente los cuernos uterinos (tubo en el paso 4.4.3) para inhibir la actividad de la tripsina. Transferir los úteros de la placa de Petri con el frío (4 ° C) HBSS + para X1 tubo que contiene 3 ml de medio MESC y agitar suavemente durante 10 s. </li> Repetir los pasos 4.4.4 (transferencia a una placa de Petri de frío (4 ° C) HBSS +) y 4.4.6 (transferencia a X2 y X3 tubo) dos veces. NOTA: Por último, este protocolo se traducirá en 4 suspensiones de células: un tubo que contiene la solución de tripsina y 3 tubos con medio que contiene MESC MESC (tubos de X1, X2 y X3). Transferencia úteros en la nueva digestión MESC, como se describe en el paso 4.4.1 y se incuba durante 30 min a 37 ° C, verticalmente. Recoger las células del estroma haciendo pasar las cuatro suspensiones de células a través de una malla de nylon 40 micras. Enjuague la malla con 5 ml adicionales de MESC. Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 7 min. Resuspender el precipitado en MESC y la placa sobre cubreobjetos recubiertos de PLL para experimentos adicionales con la densidad deseada. Se incuba durante un mínimo de 4 – 6 h u O / N a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Endometrial ratón del estroma celular (MESC) Cultura: 2ª Ronda <ol> Preparar tres pequeñas placas de Petri de frío (4 ° C) HBSS + y 3 x 15 ml tubos con 3 ml de medio MESC (Tubos Y1, Y2 e Y3). Repita los pasos 4.4.3 – 4.4.7. La transferencia de la última suspensión de células junto con los úteros a una malla de nylon 40 micras. Recoger las células del estroma haciendo pasar el contenido del tubo de Y1, Y2 y Y3 a través de la malla de nylon. Enjuague la malla con 5 ml adicionales de MESC. Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 7 min. Resuspender el precipitado en medio MESC y la placa sobre cubreobjetos recubiertos de PLL para experimentos adicionales (Figura 2b). Incubar durante un mínimo de 4-6 horas a 37 ° C con 5% de CO 2. NOTA: Para la inmunotinción o experimentos funcionales como imágenes de calcio fluorescente, se aconseja a la placa las células sobre cubreobjetos, mientras que la siembra en una placa de 6 pocillos se recomienda cuando se desea el aislamiento de ARN o proteína. 5. La vimentina/ Citoqueratina doble tinción para la Validación de MEEC Pura y culturas MESC Sembrar las células en cubreobjetos. Lavar 3 x 5 min con PBS que contiene calcio y magnesio en un agitador orbital (50 rpm). Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) (¡CUIDADO!) Durante 10 minutos, no en la coctelera. Lavar 3 veces con PBS sin calcio y magnesio en un agitador (50 rpm). Permeabilizar las células con 0,2% Triton X-100 durante 10 minutos en un agitador (50 rpm). Lavar 3 veces con PBS en un agitador. Bloquear con 5% de suero de cabra (GS) en PBS durante 2 h en un agitador (50 rpm) Se incuban las células con el conejo monoclonal anti-vimentina humana (1: 500) y el ratón monoclonal pancytokeratin anti-humana (1: 1000) a 4 ° C en un agitador (50 rpm). Los anticuerpos se diluyeron en PBS con 0,5% GS. Lavar 3 veces con PBS en un agitador (50 rpm). Se incuban las células con anticuerpos secundarios (1: 1000 en 0,5% GS) Alexa Fluor 488 conjugado con IgG anti-conejo y Alexa Fluor 488-conjucerrada IgG anti-ratón en un agitador. Lavar 3 veces con PBS en un agitador. Monte los portaobjetos con medio de montaje acuoso que contiene DAPI y O seco / N. Sellar las diapositivas con esmalte de uñas y mantener el 4 ° C para su uso posterior (Figura 2a, b). 6. En Vitro decidualization en un Sistema de Coculture NOTA: Se requieren cuatro a cinco animales para establecer un sistema de co-cultivo en una placa de 24 pocillos. Continuar con el siguiente protocolo en un ambiente estéril, preferiblemente en una cabina de flujo laminar. Preparar los insertos de cultivo celular durante las etapas de centrifugación y / o de incubación de el aislamiento de células epiteliales (como se describe en 4.3) en una placa de 24 pocillos adicional. Añadir 200 – 400 l de medio de MESC en la cantidad deseada de pocillos en la placa de 24 pocillos. Coloque los insertos en los precargadas de 24 pozos utilizando pinzas estériles. Resuspender el precipitado MEEC(Volumen de trabajo: 150 – 300 l por inserción) (paso 4.3.14) en medio MEEC y se dividen en los insertos. Cultivar las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Sembrar las células del estroma en otra placa de 24 pocillos (compatible con los insertos de cultivo celular) después de la segunda ronda de aislamiento de células del estroma (paso 4.5.6). Utilizar un volumen de trabajo de 400 l de suspensión celular por pocillo. Permitir que las células estromales se unan para un mínimo de 4 – 6 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. La transferencia de los insertos de cultivo celular cubiertos con las células epiteliales de la primera placa de 24 pocillos en la segunda placa de 24 pocillos cubierta por células estromales. El uso de fórceps esterilizados o tocar las inserciones sólo a sus pies colgando. Cultivar las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora durante un período de 3-5 d hasta que las células epiteliales formar una monocapa y las células estromales de alcanzar 80 – 90% de confluencia. Además, utilice la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)para vigilar la monocapa epitelial mediante el uso de un metro epitelial Volt / Ohm como se describe por Grant et al. 7. Los valores de 800-1.000 / pocillo eran suficientes para considerar la monocapa confluente del epitelio. Si es necesario, sustituya el medio cada 2 – 3 d usando pipetas de vidrio o puntas de pipeta fina. Comienza con la sustitución del medio de las células del estroma (sembradas en la parte inferior), antes de reemplazar el medio en los insertos. Se recomienda el uso de medio de cultivo celular precalentado a 37 ° C. Preparar el medio decidualization para inducir en decidualization vitro antes de iniciar el experimento. Utilizar un volumen de trabajo de 400 l por pocillo de las células del estroma. Preparar las siguientes soluciones madre y almacenar alícuotas a -20 ° C. Preparar 250 mM de medroxiprogesterona 17-acetato (MPA) en etanol. Preparar mM solución madre 100 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-AMPc en agua ultrapura. Hacer el medio decidual contener MPA 1 M y cAMP 0,5 mM en medio MESC que contiene 2% de SFB. Retire con cuidado el medio de los pocillos y añadir el medio decidual en las células del estroma. Si se necesita una condición de control, utilice el medio MESC que contiene 2% de FBS. Retire el medio de los insertos de cultivo celular y añadir 300 l de medio MEEC sobre las células. Se incuban las células durante 5 d en una incubadora a 37 ° C en 5% de CO 2. Después del quinto día, evaluar el alcance de decidualization en las células del estroma por RT-qPCR (véase más adelante). Validar la viabilidad de las células epiteliales utilizando el reactivo de viabilidad basado en resazurina. Preparar una solución 01:10 de reactivo de la viabilidad en medio MEEC. La transferencia de los insertos de cultivo celular en una nueva placa de 24 pocillos. Añadir 150 – 300 l de reactivo de viabilidad – solución MEEC sobre las células. Incubar a 37 ° C en 5% de CO 2 durante por lomenos 4 – 5 h o durante la noche y evaluar la viabilidad celular mediante la observación de un cambio de color (azul y el violeta / rosa). NOTA: decidualization también se puede evaluar usando un ELISA de ratón prolactina-específico, como preferido por el investigador. 7.Validation de decidualization de QRT-PCR NOTA: Para la validación de la decidualization de QRT-PCR, se recomienda llevar a cabo todas las pruebas en condiciones duplicado con el fin de recibir una cantidad suficiente de células para el análisis de ARN. RT-PCR cuantitativa se realizó como se describió anteriormente en De Clercq et al. 8. En breve: Aislar el ARN total usando un kit de aislamiento de ARN comercial. Evaluar la cantidad y la calidad del ARN usando métodos comerciales de acuerdo con el protocolo del fabricante, respectivamente. Sintetizar ADNc, según el protocolo del fabricante a partir de 1 g de ARN total. Utilice un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante para llevar a cabo la reacción de QRT-PCR. Ejecutar todas las muestras por triplicado. Hacer uso de la comercial TaqMan Master Mix y sondas TaqMan específicas para los genes de limpieza deseados y prolactina (prl8a2) para llevar a cabo la reacción.