Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet
Summary
This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Abstract
Diese detaillierte Protokoll beschreibt die Umsetzung von bildgeführten, laserbasierten Hydrogel Abbau zur Herstellung von vaskulären abgeleitetes mikrofluidischen Netzwerken in PEGDA-Hydrogele eingebettet. Hier beschreiben wir die Erstellung von virtuellen Masken, die für bildgesteuerte Lasersteuerung ermöglichen; die Photopolymerisation eines micromolded PEGDA Hydrogel, geeignet für mikrofluidische Netzwerk Herstellung und Druckkopf getriebenen Strömung; der Aufbau und die Verwendung eines handelsüblichen Konfokalmikroskop Laser-Scanning mit einer Femtosekundenimpuls Ti gepaart: S Laser Hydrogels Abbau zu induzieren; und die Abbildung von fabrizierten mikrofluidischen Netzwerken unter Verwendung von fluoreszierenden Spezies und konfokaler Mikroskopie. Ein großer Teil des Protokolls ist auf der richtigen Aufstellung und Umsetzung des Mikroskop-Software und Mikroskop Makro konzentriert, da diese entscheidenden Schritte sind eine kommerzielle Mikroskop für mikrofluidische Herstellungszwecke verwendet, die eine Reihe von Feinheiten enthalten. Die bildgesteuerte Komponente dieses technique ermöglicht die Durchführung von 3D-Bildstapeln oder benutzergenerierten 3D-Modellen, wodurch für kreative mikrofluidischen Design ermöglicht und für die Herstellung von komplexen mikrofluidischen Systemen praktisch jeder Konfiguration. Mit einem erwarteten Auswirkungen in Tissue Engineering, die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren könnten bei der Herstellung von fortgeschrittenen biomimetische microtissue Konstrukte unterstützen für Organ- und Menschen-on-a-Chip-Geräte. Durch Nachahmung die komplexe Architektur, die Verwindung, die Größe und Dichte der in vivo Vaskulatur können essentielle biologische Transportprozesse in diesen Konstrukten repliziert werden, was zu genaueren in vitro – Modellierung von Arzneimittel Pharmakokinetik und Krankheit.
Introduction
Das Gefäßsystem, die beide Lymph- und cardiovasculature besteht, bildet hochdichte Netzwerke, die für den Transport von Nährstoffen und Sauerstoff und zur Entfernung von Stoffwechselabfall wesentlich sind. Dementsprechend sind in bluteten Geweben mit Wohnsitz Zellen nie mehr als 50 bis 100 & mgr; m entfernt von einem Behälter 1. Die Fähigkeit , in vivo vaskuläre Architektur in vitro zu reproduzieren , ist kritisch , um genau in vivo Transportprozesse modellieren Konstrukte verwenden. Mit einer aktuellen Antriebs Orgel-on-a-Chip – Vorrichtungen 2 für Hochdurchsatz – Medikament zu entwickeln Screening 3,4 und Krankheit Modellierung 5,6, zu Methoden mikrofluidischen Netzwerken schaffen , die in vivo -ähnlichen Transport in synthetischen oder natürlichen Hydrogelen rekapitulieren zeichnen großes Interesse. Um die biomimicry von microtissues verbessern in diesen Geräten verwendet werden, entwickelten wir ein bildgeführtes, laserbasierten Hydrogel-Abbauverfahren, das drei-MASS nutztl (3D) Bildstapel von nativen Gefäß als Vorlagen in PEGDA Hydrogele 7 Gefäß abgeleiteten mikrofluidischen Netzwerken eingebettet zu erzeugen. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines handelsüblichen Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit einem Femtosekundenimpulslaser ausgestattet vaskulären abgeleitetes, biomimetische mikrofluidischen Netzwerke in PEGDA-Hydrogele über bildgeführte, laserbasierten Abbau herzustellen.
Aktuelle Ansätze Hydrogele zu fluidisieren umfassen die Induktion von vaskulogenischen 8-10 oder 10-12 angiogene Endothelzelle Selbstorganisation und Mikrofabrikationstechniken vordefinierten Kanäle für 13-16 Endothelialisierung zu schaffen. Während selbstorganisierende Netzwerke die Dichte und die komplexe Architektur von microvasculature rekapitulieren, sind sie oft durchlässiger als in – vivo – Netzwerke 11,17,18, die für Wirkstoff – Screening – Anwendungen in der Modellierung Transport problematisch sein kann. Selbstorganisierende Netzwerke bestehen aus physiologtisch relevant, Kapillar große Schiffe, aber sie können bei der Erzeugung von größeren Arteriolen große Schiffe aufgrund von Einschränkungen mit Hauptfluidströmung schwierig zu integrieren sein. Da es keine direkte Kontrolle über die Anordnung dieser Netze ist, kann die endgültige Architektur von Probe zu Probe variieren, was es schwierig macht, um wiederholt Netzwerke mit den gleichen Fluidstrom und Transporteigenschaften herzustellen.
Zu erzeugen , 3D, Hydrogel eingebettet mikrofluidischen Netzwerken mit wiederholbaren Geometrie und gut definierte Architektur, eine Reihe von Mikrofabrikationstechniken wurden entwickelt, einschließlich modulare Baugruppe 13, 3D – Drucken von Opfermaterialien 16, Montage Direktschreib 14 und omnidirektionalen Druck 15. Die Anwendung dieser Methoden, mikrofluidische Architektur und damit Strömungs- und Transporteigenschaften können wiederholt über viele Konstrukte hergestellt werden. Eine große Einschränkung dieser Ansätze ist jedoch die Unfähigkeit microf zu erstellenluidic Netzwerke mit Kapillar-Größe Merkmale, 4 bis 10 um 19. 150-650 & mgr; m im Durchmesser 13,16 Bereich meisten Mikrofabrikationstechniken werden häufig auf Merkmale beschränkt. Einige existierende Techniken sind in der Lage zur Erzeugung von hierarchischen Netzwerken mit Kanälen in einem breiten Durchmesserbereich von 10 bis 300 um für die Direktschreibanordnung 14, und 18 bis 600 um für omnidirektionale Druck 15, aber sie sind in ihrer Fähigkeit begrenzt dichte Netze zu erzeugen oder mehrere Mikrofluidik – Netzwerke in der Nähe in einem einzigen Konstrukt 7 zu erzeugen.
Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine bildgeführte, laserbasierten Hydrogel Abbautechnik , die wiederholbare Herstellung von biomimetischen ermöglicht, hierarchische mikrofluidischen Netzwerken , die die Architektur der in vivo microvasculature rekapitulieren. Dazu ein 790 nm, 140 Femtosekunden (fs) gepulster Laser, der bei 80 MHz arbeitet, ist rasterabgetasteten in 3D – Positionen innerhalb eines Hydrogels gewünscht, wie es durch Bilder von in vivo Vaskulatur definiert. Wir vermuten , dass der Abbauprozess der laserinduzierten optischen Durchbruch von Wasser arbeitet durch, die resultierende Plasmabildung, die anschließende schnelle thermo Ausdehnung des Wassers und dem lokalen Abbau des Hydrogels als das Wasser 20 erweitert. Dieser Mechanismus unterscheidet sich etwas von laserbasierten Abbau von Protein-basierten Hydrogelen 21-24. Im Gegensatz PEGDA, die einen niedrigen Multiphotonen- Querschnitt hat, Proteine haben oft eine große Multiquerschnitt auf und sind daher über einen Mehrphotonen – Absorption induzierten chemischen Bruch 23 abgebaut. Zur bildgeführten mikrofluidischen Netzwerken, die Laserverschlußeinrichtung wird gesteuert durch bild abgeleitet virtuellen Masken, die aus einem Mosaik von interessierenden Bereichen 9 , die definieren , die mikrofluidische Architektur erzeugen. Mit diesem Ansatz haben wir die Fähigkeit unter Beweis gestellt biomimetische mikrofluidischen herzustellen 3D-Gefäß abgeleitetenic Netzwerke, welche die dichte und gewundene Architektur in vivo Gefäß rekapitulieren, steuern , um lokal die Porosität von Hydrogelen durch die Menge an Energie während des Abbaus geliefert zu verändern. Wir haben auch in der Lage gewesen , zwei unabhängige mikrofluidischen Netzwerken zu erzeugen , die sich in unmittelbarer Nähe verflechten (15 & mgr; m) , aber nie direkt 7 verbinden. Wir haben gezeigt , auch die Fähigkeit , Laser-abgebauten Mikrokanäle durch Post Abbau Funktionalisierung mit dem Integrin Ligieren Peptidsequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin (RGDS) zu endothelialisieren, 7 endothelialen Zelladhäsion und Lumenbildung zu fördern.
Mit diesem Protokoll wird die Erzeugung von komplexen mikrofluidischen Netzwerken in PEGDA Hydrogele möglich über die bildgesteuerte, laserbasierte Abbau eines im Handel erhältlichen Mikroskop zugänglich an vielen Universitäten verwendet. Da der Abbauprozess durch digitale, virtuelle Masken geführt wird, diese Fabricaçãotechnik ist für die kreative Gestaltung von mikrofluidischen Netzwerken zugänglich, seine Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen ermöglicht. Wir gehen davon aus, dass das hier beschriebene Verfahren am vorteilhaftesten sein wird biomimetische Organ- und Menschen-on-a-Chip – Vorrichtungen, die replizierende biologische Transportprozesse wichtig bei der Modellierung Arzneimitteltransport 2 in der Gestaltung. Diese Herstellungstechnik kann auch für die Erzeugung von in – vitro – Krankheitsmodellen von Interesse sein, einschließlich Krebsmetastasen 5,6 und Blut-Hirn – Schranke Modelle 25. Als laserbasierten Hydrogel Abbau zuvor verwendet wurde , Spuren für die Führung der neuronalen Auswachsens 21-23, die bildgeführte Erweiterung dieser Technik zu schaffen , könnten Zellen in benutzerdefinierten 3D räumlichen Anordnungen als nützlich erweisen , in Strategien Engineering Advanced Tissue zu positionieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritisch in die Standardfunktionen des Mikroskop-Software überschreibt die Verwendung von virtuellen Masken für bildgesteuerte, laserbasierte Abbau zu ermöglichen, muss das Mikroskop Makro sorgfältig Setup und manipuliert werden. Wie die Mikroskop-Software-Schnittstellen mit dem Mikroskop Makro kann manchmal nicht eingängig sein, und viel Aufwand wurde bei der Ermittlung der optimalen Einstellungen in beiden Programmen investiert, um diese Methode zu entwickeln. Ein allgemeines Verständnis der grundlegenden Laser-Scanning-Konfokalmikroskop Verwendung wird empfohlen, insbesondere mit der "Stufe" und "Focus" Fenster für das Auffinden und die Positionierung korrekt des Hydrogels in den x, y und z-Dimensionen, vor laserbasierten Abbau versucht. Darüber hinaus ist die Herstellung eines Einlasskanals zum Protokoll kritisch; suspendiert fluoreszierende Spezies müssen die mikrofluidische Systeme für die erfolgreiche Bildgebung und Netzwerk Charakterisierung eingeben können. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll zu einem bestimmten gilt laser-konfokalen Mikroskop mit einem bestimmten Femtosekunden gepulsten Laser konfiguriert, laufen bestimmte Versionen der Mikroskop-Software und das Mikroskop-Makro (siehe Details in der Liste der spezifische Materialien / Ausrüstung). Wir haben entdeckt, dass neuere Versionen des Mikroskops Makro fehlt die notwendige Kontrolle und Funktionalität für bildgesteuerte Lasersteuerung benötigt. Während andere Mikroskop Plattformen und gepulste Laserquellen verwendet werden kann, wendet dieses Protokoll für dieses System spezifisch und Modifikation benötigen nach der Plattform Laserquelle und implementierte Software. Die zugrunde liegenden Prinzipien in diesem Protokoll gelten jedoch weiterhin.
Eine mögliche Änderung dieses Protokoll beinhaltet die Änderung der Hydrogel-Zusammensetzung. Hier verwendeten wir 5 Gew%, 3,4 kDa PEGDA Hydrogele, aber laserbasierten Abbau (für die Zwecke abgesehen von mikrofluidischen Netzwerk Generation) implementiert wurde sowohl synthetische als auch natürliche Hydrogele abzubauen, einschließlich pegyliertes Fibrinogen 21,22, Seidenprotein Hydrogele 23 und Kollagen 24. Die Einstellung der Laserleistung, Abtastgeschwindigkeit, den Abstand zwischen den Z-Scheiben, und die Anzahl der Wiederholungen wird bei der Bestimmung der optimalen Parameter unterstützen zu mikrofluidischen Netzwerken in anderen Hydrogel-Formulierungen herzustellen.
Eine Strombegrenzung der Technik ist das Gesamtvolumen des Hydrogels, das in einem durchführbar Zeitspanne abgebaut werden kann. Um offene Hohlräume oder mikrofluidischen Funktionen innerhalb des Hydrogels schaffen, wohnen die Laserzeit muss bei oder über 8,96 & mgr; s / Pixel (oder eine Laser – Scan – Geschwindigkeit von 0,021 & mgr; m / & mgr; s) , wenn ein Laser – Fluenz von 37,7 nJ / & mgr; m 2 verwendet wird . Mit diesen Einstellungen, dauert es 1,4 h Gefäße zu degradieren innerhalb eines 0,014 mm 3 Volumen (wie in Abbildung 1 zu sehen ist ). Mit einem Laser Verweilzeit von 4,48 & mgr; s / Pixel oder unten, lieferte die Energie ist nicht genug für die vollständige Abbau des Hydrogels Formulierung hier verwendet. Die Implementierung eines unterschiedlichen HydrogelZusammensetzung könnte diese Einschränkung zu überwinden. Die Verwendung von photolabilen Gele , die lichtempfindlichen Komponenten 34-36 oder Hydrogele enthalten , die große Mehrphotonenquerschnitte 21-24 sind gute Möglichkeiten, die die Verwendung von weniger Energie ermöglichen würde und zu einem schnelleren Abbau führen würde. Im Hinblick auf Maßbegrenzungen wurden Merkmale bis 1,5 mm tief in das Hydrogel 7 hergestellt werden. Die Tiefe erzielbar ist eine Funktion des Arbeitsabstands der Objektiv und kann mit extrem großen Arbeitsabstand Ziele für in vivo Bildgebung optimiert werden erhöht. Der kleinste gemessene Kanal 7 erstellt ein 20X (NA1.0) Wasserimmersionsobjektiv mit hatte eine Breite von 3,3 & mgr; m und einer Tiefe von 8,9 um, die mit der Größe der kleinsten Kanäle auf einer Stufe erzeugt wird in Abbildung 1. Während andere Labore niedriger NA Ziele 21,23,24 verwendet haben, erwarten wir , dass mikrofluidischen Netzwerken mit kleineren Merkmalen hohe erzeugt werden kann unter Verwendung voner NA Ziele auf Kosten eines reduzierten Arbeitsabstand. Letztlich aber die Auflösung der Technik ist eine Funktion der Punktverteilungsfunktion des fokussierten Laserstrahls, die Laserscan Eigenschaften, die Menge an Energie, die durch den Laser geliefert, und die Laserabsorptionseigenschaften des Materials verschlechtert wird.
Proteinbasis gegen synthetische: Weiterhin Lasereigenschaften (Geschwindigkeit, Fluenz, der Abstand zwischen der virtuellen Masken und die Anzahl der Wiederholungen) sind basierend auf Hydrogeleigenschaften (Vernetzungsdichte, Makromer / Monomer-Molekulargewicht, Gewichtsprozent, und der Art des Hydrogels optimiert wie diese), werden von Natur aus Interaktionen mit dem Laser zu verändern und damit die endgültige Auflösung des Prozesses. Da die zugeführte Energie auch durch das Ziel verwendet wird, zusätzliche Optimierungs beeinflusst wird erforderlich, wenn zwischen den Zielsetzungen Schalt. Im Hinblick auf die damit verbundenen Kosten, der Zugang zu einem Mikroskop mit einem gepulsten Laser erforderlich ist, und während viele verschiedene objectiven kann verwendet werden, können solche mit einer hohen NA und langen Arbeitsabstand (für in vivo imaging) teuer sein.
Darüber hinaus das Protokoll hier detailliert, erzeugt mikrofluidischen Netzwerken unter Verwendung dieser Technik kann auch mit zelladhäsive Peptide post-Kanal Fertigung funktionalisiert werden 7 Endothelzelladhäsion und Lumenbildung zu induzieren. Zusätzlich könnte der Einbau von zell abbaubares Peptidsequenzen in das Schüttgut 9 vor Degradation zu Kanal für die Untersuchung der Zellwanderung erlauben , in und durch das Hydrogel. Für eine kontinuierliche Fluidisierung des Mikrofluidik – Netzes innerhalb des Hydrogels können Hydrogele in größeren fluidischen Vorrichtungen oder Gehäuse photopolymerisiert werden, wie 7 in den Figuren 2 und 3 gezeigt.
Die Erzeugung von Gefäßnetze über vaskulogener oder angiogenen Selbstorganisation 8-12 bietet einen einfachen Ansatz va zu induzierenscularization über einen relativ großen Volumen Hydrogels. Während dieser Ansatz in perfundierbaren fluidische Netzwerke ergibt, ist es schwierig, direkt die Größe zu steuern, Tortuosität, Dichte und Gesamtnetzarchitektur. Aufgrund dieser Einschränkung kann das Strömungsprofil und die Scherraten in der Vaskulatur zwischen den Experimenten unterscheiden. Alternativ erlauben Techniken Mikro 13-16 für die direkte Kontrolle über die Netzwerk – Architektur werden jedoch oft begrenzt durch ihre Unfähigkeit , kleine, Kapillar-Größe Kanäle oder die Herstellung von dichten Netzen zu erzeugen , die in vivo Gefäßarchitektur nachahmen. Während der Laser-basierten Hydrogel Abbautechnik skizzierte hat für mikrofluidische Generation repurposed neu ist, überwindet sie gleichzeitig sowohl die architektonische Kontrolle und größenbasierte Grenzen der bestehenden Mikrofabrikationsmethoden durch die Erstellung von 3D biomimetische mikrofluidischen Netzwerken ermöglicht, die die Dichte, die Verwindung rekapitulieren, Größenbereich, und die allgemeine architecture von in vivo Vaskulatur. Darüber hinaus können mehrere fluidische Netzwerke in einem Hydrogel erzeugt werden, so dass die Untersuchung von Internetzwerktransport 7. Für Tissue – Engineering – Anwendungen , die mehr replizieren eng in vivo Transportprozesse in vitro streben danach, die hochaufgelöste Hydrogel eingebettet mikrofluidischen Netzwerken hier skizziert sind gut geeignet. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll in Entwicklungsgewebekonstrukte nützlich sein wird , dass genauer nachahmen in vivo Transport für die Verwendung als Arzneimittel – Screening – Geräte und In – vitro – Krankheitsmodellen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
Materials
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
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