, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l'image
Summary
This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Abstract
Ce protocole décrit en détail la mise en oeuvre guidée par l'image, la dégradation d'hydrogel à base de laser pour la fabrication de réseaux vasculaires microfluidiques dérivé incorporés dans les hydrogels PEGDA. Ici, nous décrivons la création de masques virtuels qui permettent un contrôle laser guidée par l'image; la photopolymérisation d'un hydrogel PEGDA micromolded, propres à la fabrication de réseau microfluidique et le flux de tête commandé par la pression; la configuration et l'utilisation d'un microscope à balayage laser confocal disponible dans le commerce associé à un pulsé Ti femtoseconde: laser S pour induire la dégradation d'hydrogel; et l'imagerie des réseaux microfluidiques fabriqués en utilisant des espèces fluorescentes et la microscopie confocale. Une grande partie du protocole est axé sur la bonne configuration et la mise en œuvre du logiciel de microscope et microscope macro, car ce sont des étapes cruciales dans l'aide d'un microscope commercial à des fins de fabrication microfluidiques qui contiennent un certain nombre de subtilités. La composante guidée par l'image de cette technique permet la mise en œuvre de 3D piles d'images ou de modèles 3D générés par les utilisateurs, ce qui permet pour la conception créative et microfluidique pour la fabrication de systèmes microfluidiques complexes de pratiquement toutes les configurations. Avec un impact attendu dans l'ingénierie tissulaire, les méthodes décrites dans ce protocole pourraient aider à la fabrication de pointe constructions Microbroyeur biomimétiques pour les appareils nisations et humains-on-a-chip. En mimant le complexe l' architecture, la tortuosité, la taille et la densité de la vascularisation in vivo, des processus de transport biologiques essentiels peuvent être reproduits dans ces constructions, ce qui conduit à une modélisation plus précise in vitro des propriétés pharmacocinétiques de la drogue et des maladies.
Introduction
Le système vasculaire, comprenant à la fois lymphatique et cardiovasculature, formes de réseaux très denses qui sont essentiels pour le transport des nutriments et de l'oxygène et pour l'élimination des déchets métaboliques. En conséquence, les cellules résidant dans les tissus vascularisés ne sont jamais plus de 50-100 um loin d'un récipient 1. La capacité de se reproduire in vivo dans l' architecture vasculaire in vitro est critique pour modéliser avec précision les processus de transport in vivo en utilisant des constructions artificielles. Avec un entraînement récent pour développer des dispositifs d' organes sur une puce 2 pour haut débit médicament dépistage 3,4 et la modélisation des maladies 5,6, les méthodes pour créer des réseaux microfluidiques qui récapitulent le transport in vivo -comme dans des hydrogels synthétiques ou naturels sont le dessin un intérêt significatif. Pour améliorer la biomimétisme de microtissues utilisés dans ces dispositifs, nous avons développé une méthode de dégradation d'hydrogel à base de laser guidée par l'image qui utilise trois dimensional ' image (3D) des piles de vascularisation native en tant que modèles pour générer des réseaux microfluidiques vasculaires dérivés intégrés dans PEGDA hydrogels 7. Ce protocole décrit l'utilisation d'un laser à balayage confocal microscope disponibles dans le commerce équipé d'un laser à impulsions femtoseconde pour fabriquer des réseaux microfluidiques biomimétiques vasculaires dérivées dans des hydrogels PEGDA par dégradation à base de laser guidée par l'image.
Les approches actuelles pour fluidiser hydrogels comprennent l'induction de vasculogenic 8-10 ou 10-12 techniques cellules endothéliales d' auto-assemblage et de microfabrication angiogéniques pour créer des canaux pré-définis pour endothélialisation 13-16. Bien que les réseaux auto-assemblées récapitulent la densité et de l' architecture complexe du système microvasculaire, ils sont souvent plus perméables que les réseaux 11,17,18 in vivo, ce qui peut être problématique dans le transport de modélisation pour des applications de criblage de médicaments. Réseaux auto-assemblés sont constitués de physiologie dematiquement pertinentes, les vaisseaux capillaires de taille, mais ils peuvent être difficiles à intégrer à l'écoulement du fluide en vrac en raison des limitations de générer de plus grands navires de artériole taille. Comme il n'y a pas de contrôle direct sur l'ensemble de ces réseaux, l'architecture finale peut varier d'un échantillon à, ce qui rend difficile de produire de façon répétée des réseaux avec les mêmes propriétés d'écoulement et de transport de fluides.
Pour générer 3D, réseaux microfluidiques hydrogel embarqué à géométrie répétitive et une architecture bien définie, un certain nombre de techniques de microfabrication ont été développées, y compris l' assemblage modulaire 13, l' impression 3D de matériaux sacrificiels 16, assemblage écriture directe 14, et l' impression omnidirectionnelle 15. L'application de ces méthodes, l'architecture microfluidique, et les propriétés d'écoulement et de transport de fluide donc, peut être fabriqué de façon répétée à travers de nombreuses constructions. Une limitation importante de ces méthodes, cependant, est l'incapacité de créer microfréseaux luidic avec des caractéristiques capillaires moyenne, 4 à 10 um 19. La plupart des techniques de microfabrication sont souvent limitées à des fonctionnalités allant de 150 à 650 um de diamètre 13,16. Certaines techniques existantes sont capables de générer des réseaux hiérarchiques avec des canaux à travers une large plage de diamètres de 10 à 300 um pour le montage direct-écriture 14, et 18 à 600 um pour l' impression omnidirectionnelle 15, mais ils sont limités dans leur capacité à générer des réseaux denses ou pour produire de multiples réseaux microfluidiques à proximité dans un seul construction 7.
Pour surmonter certaines de ces limitations, nous avons développé une technique de dégradation d'hydrogel à base de laser guidée par l' image qui permet la fabrication reproductible de biomimétique, réseaux microfluidiques hiérarchiques qui récapitulent l'architecture microvasculaire in vivo. Pour ce faire, un 790 nm, 140 femtoseconde (fs) laser pulsé fonctionnant à 80 MHz est raster scannée in emplacements 3D désirée à l' intérieur d' un hydrogel tel que défini par les images de la vascularisation in vivo. Nous pensons que le processus de dégradation fonctionne grâce à la décomposition induite par laser optique de l' eau, la formation du plasma qui en résulte, l'expansion rapide thermoélastique subséquente de l' eau et de la dégradation locale de l'hydrogel que l'eau se dilate 20. Ce mécanisme varie légèrement d' une dégradation à base de laser d'hydrogels à base de protéines 21-24. A la différence PEGDA, qui a une section transversale multiphotonique bas, les protéines ont souvent une grande section transversale multiphotonique et sont donc dégradées par l' intermédiaire d' une absorption multiphotonique induite par bris chimique 23. Pour générer des réseaux microfluidiques guidée par l' image, l'obturateur laser est contrôlé par des masques virtuels images dérivées, qui sont constitués d'une mosaïque de régions d'intérêt 9 qui définissent l'architecture microfluidique. En utilisant cette approche, nous avons démontré la capacité de fabriquer des microfluidique biomimétique 3D vasculaire dérivéles réseaux de circuits intégrés, ce qui récapitulent l'architecture dense et tortueuse du système vasculaire in vivo, afin de contrôler localement la porosité des hydrogels en modifiant la quantité d'énergie délivrée au cours de la dégradation. Nous avons également été en mesure de générer deux réseaux microfluidiques indépendants qui entrelacent à proximité (15 um) , mais ne se connectent jamais directement 7. Nous avons également démontré la capacité de endothélialiser microcanaux laser dégradé par la poste dégradation fonctionnalisation avec la séquence peptidique de l' intégrine ligaturer, Arginine-glycine-acide aspartique-sérine (RGDS) pour favoriser l' adhérence des cellules endotheliales et la formation de la lumière 7.
Avec ce protocole, la génération de réseaux microfluidiques complexes hydrogels PEGDA est rendue possible par l'intermédiaire, la dégradation à base de laser guidée par l'image à l'aide d'un microscope disponible dans le commerce accessible sur de nombreux campus universitaires. Comme le processus de dégradation est guidé par des masques virtuels numériques, ce fabricaTechnique tion se prête à la conception des réseaux de création microfluidique, permettant son utilisation dans une large variété d'applications. Nous prévoyons que la méthode décrite ici sera la plus avantageuse dans la conception de dispositifs nisations et humains-on-a-chip biomimétiques capables de reproduire les processus de transport biologiques importants dans la modélisation drogues transport 2. Cette technique de fabrication peut également être intéressant pour la génération des modèles in vitro de maladies, y compris les métastases du cancer et des modèles de 5,6 barrière hémato-encéphalique 25. Comme la dégradation d'hydrogel à base de laser a déjà été utilisé pour créer des pistes pour la direction de l' excroissance neuronale 21-23, l'extension de cette technique guidée par l' image pourrait se révéler utile dans les stratégies d'ingénierie tissulaire avancées pour positionner les cellules dans des arrangements spatiaux 3D définis par l' utilisateur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Critique en remplaçant les fonctions standard du logiciel de microscope pour permettre l'utilisation de masques virtuels pour, la dégradation à base de laser guidée par l'image, la macro microscope doit être installé et manipulé avec précaution. Comment les interfaces logicielles de microscope avec la macro microscope peuvent parfois être contre-intuitif, et beaucoup d'efforts ont été investis dans la détermination des paramètres optimaux dans les deux programmes pour développer cette méthode. Une compréhension générale de balayage laser de base l'utilisation du microscope confocal est recommandé, en particulier avec le "Stage" et les fenêtres "Focus" pour trouver et correctement le positionnement de l'hydrogel dans les x, y et z dimensions, avant de tenter la dégradation à base de laser. En outre, la fabrication d'un canal d'entrée est critique pour le protocole; espèces fluorescentes suspendues doivent être en mesure d'entrer dans les systèmes microfluidiques pour l'imagerie et la caractérisation réussie du réseau. Il est important de noter que ce protocole applique à un particulier au lasermicroscope confocal à balayage configuré avec un laser à impulsions femtoseconde spécifique, exécutant des versions spécifiques du logiciel de microscope et la macro microscope (voir les détails dans la liste des matières spécifiques / Équipement). Nous avons découvert que les nouvelles versions de la macro microscope manque le contrôle et la fonctionnalité nécessaire nécessaire pour le contrôle de laser guidée par l'image. Alors que d'autres plates-formes de microscope et des sources laser à impulsions peuvent être utilisés, ce protocole spécifiquement applicable à ce système et devra être modifiée en fonction de la plate-forme, une source laser, et le logiciel mis en oeuvre. Les principes sous-jacents à travers ce protocole appliquent toujours, cependant.
Une modification possible à ce protocole implique la modification de la composition d'hydrogel. Ici, nous avons utilisé 5% en poids, 3,4 hydrogels kDa PEGDA, mais la dégradation à base de laser (à des fins en dehors de la génération du réseau microfluidique) a été mis en œuvre pour dégrader les deux hydrogels synthétiques et naturelles, y compris pégylé fibrine21,22 plasmine, protéine de soie hydrogels 23 et 24 du collagène. Réglage de la puissance du laser, la vitesse de balayage, l'espacement entre les Z-tranches, et le nombre de répétitions aidera à déterminer les paramètres optimaux pour fabriquer des réseaux microfluidiques dans d'autres formulations d'hydrogel.
Une limitation du courant de la technique est le volume global d'hydrogel qui peut être dégradé dans une quantité de temps possible. Pour créer des vides ouverts ou des caractéristiques microfluidiques au sein de l'hydrogel, le laser temps de séjour doit être égale ou supérieure à 8,96 ps / pixel (ou une vitesse de balayage laser de 0,021 um / uS) lorsque vous utilisez une fluence laser de 37,7 nJ / um 2. Avec ces paramètres, il faut 1,4 heures pour dégrader les vaisseaux dans un volume de 0,014 mm 3 (comme on le voit sur la figure 1). En utilisant un temps d'arrêt du laser de 4,48 ps / pixel ou au-dessous, l'énergie fournie ne suffit pas pour la dégradation totale de la formulation d'hydrogel utilisé ici. La mise en œuvre d'un hydrogel différentcomposition pourrait surmonter cette limitation. L'utilisation de gels photolabiles qui contiennent des composants sensibles à la lumière 34-36 ou hydrogels qui ont un grand multiphotonique sections 21-24 sont de bonnes options qui permettraient d'utiliser moins d' énergie et se traduirait par une dégradation plus rapide. En ce qui concerne les limitations dimensionnelles, les caractéristiques ont été fabriquées jusqu'à 1,5 mm de profondeur dans l'hydrogel 7. L'atteinte de la profondeur est fonction de la distance de travail de l'objectif et peut être augmentée en utilisant des objectifs de la distance de travail ultra-longues optimisés pour l' imagerie in vivo. Le canal le plus petit mesuré 7 créé en utilisant un 20X (NA1.0) objectif d'immersion de l' eau avait une largeur de 3,3 um et une profondeur de 8,9 um, ce qui est comparable à la taille des plus petits canaux générés dans la figure 1. Alors que d' autres laboratoires ont utilisé des objectifs NA inférieurs 21,23,24, nous prévoyons que les réseaux microfluidiques avec de petites fonctionnalités peuvent être générées à l' aide de hautobjectifs er NA au détriment d'une distance de travail réduite. En fin de compte, cependant, la résolution de la technique est une fonction de la fonction d'étalement de point du faisceau laser focalisé, les propriétés de balayage laser, la quantité d'énergie délivrée par le laser, et les propriétés d'absorption laser du matériau se dégradent.
En outre, les propriétés laser (vitesse, fluence, l'espacement entre les masques virtuels, et le nombre de répétitions) doivent être optimisées en fonction des propriétés d'hydrogel (densité de réticulation, macromère / poids de monomère moléculaire, pour cent en poids, et le type d'hydrogel: à base de protéines par rapport synthétique ), car ceux-ci intrinsèquement modifier les interactions avec le laser et donc la résolution ultime du processus. En tant que l'énergie fournie est également influencée par l'objectif utilisé, une optimisation supplémentaire est nécessaire lors de la commutation entre les objectifs. En ce qui concerne les coûts, l'accès à un microscope avec un laser pulsé est nécessaire, et tandis que de nombreux différents objectives peuvent être utilisés, ceux qui ont une haute NA et longue distance de travail (pour l' imagerie in vivo) peut être coûteux.
Au- dessus et au – delà du protocole détaillé ici, les réseaux microfluidiques générés en utilisant cette technique peuvent également être fonctionnalisés avec des peptides de cellules-adhésif post-canal fabrication pour induire l' adhérence des cellules endothéliales et la formation de lumière 7. En outre, l'incorporation de séquences de peptides cellulaires dégradable dans le matériau en vrac avant 9 pour canaliser la dégradation pourrait permettre l'étude de la migration des cellules dans et à travers l'hydrogel. Pour la fluidification continue du réseau microfluidique au sein de l'hydrogel, les hydrogels peuvent être photopolymérisées dans des dispositifs fluidiques ou des boîtiers plus importants, comme le montrent les figures 2 et 3 7.
La génération de réseaux vasculaires par auto-assemblage vasculogenic ou angiogénique 8-12 fournit une approche simple pour induire vascularization à travers un volume relativement important d'hydrogel. Bien que cette approche se traduit par des réseaux fluidiques irrigables, il est difficile de contrôler directement la taille, la tortuosité, la densité et l'architecture globale du réseau. En raison de cette limitation, le profil d'écoulement et les vitesses de cisaillement dans le système vasculaire peuvent varier entre les expériences. Alternativement, des techniques de microfabrication 13-16 permettent un contrôle direct sur l' architecture du réseau , mais sont souvent limités par leur incapacité à générer des petits canaux, capillaires de taille ou la fabrication de réseaux denses qui imitent l'architecture vasculaire in vivo. Alors que l'hydrogel technique de dégradation à base de laser décrite ici a été récemment reconverti pour la génération microfluidique, il surmonte simultanément le contrôle architectural et les limites fondées sur la taille des méthodes de microfabrication existantes en permettant la création de réseaux microfluidiques biomimétiques 3D qui récapitulent la densité, la tortuosité, gamme de taille et architectur globalee du système vasculaire in vivo. En outre, de multiples réseaux fluidiques peuvent être générés dans un seul hydrogel, permettant l'étude du transport inter-réseau 7. Pour les applications d'ingénierie tissulaire qui cherchent à répliquer plus étroitement dans les processus de transport in vivo in vitro, les réseaux microfluidiques hydrogel intégré à haute résolution présentées ici sont bien adaptés. Nous prévoyons que ce protocole sera utile dans le développement de constructions de tissu que le transport plus précisément mimique in vivo pour une utilisation en tant que dispositifs de dépistage de drogues et dans les modèles de la maladie in vitro.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
Materials
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
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