Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati
Summary
This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Abstract
Questo protocollo dettagliato descrive l'attuazione guidata dalle immagini, degradazione idrogel laser per la realizzazione di reti microfluidica vascolari derivate incorporati in idrogel PEGDA. Qui, descriviamo la creazione di maschere virtuali che permettono di controllo laser guidata dalle immagini; la fotopolimerizzazione di un idrogel PEGDA micromolded, adatto per microfluidica realizzazione della rete e il flusso di testa-driven pressione; l'installazione e l'uso di una scansione laser microscopio confocale disponibile in commercio in coppia con un femtosecondi impulsi laser Ti: S per indurre la degradazione idrogel; e l'imaging reti microfluidica fabbricati usando specie fluorescenti e microscopia confocale. Gran parte del protocollo è focalizzata sulla corretta configurazione e implementazione del software microscopio e il microscopio macro, in quanto questi rappresentano passi decisivi nel mezzo di un microscopio commerciale a fini di fabbricazione microfluidici che contengono una serie di complicazioni. La componente guidata dalle immagini di questa technique consente l'implementazione di pile di immagini 3D o modelli 3D generati dall'utente, consentendo in tal modo per la progettazione microfluidica creativo e per la realizzazione di complessi sistemi microfluidici qualsiasi configurazione. Con un impatto previsto in ingegneria dei tessuti, i metodi descritti in questo protocollo potrebbe aiutare nella realizzazione di avanzati costrutti biomimetici microtessuto per i dispositivi di organismi e umane-on-a-chip. Imitando la complessa architettura, tortuosità, la dimensione e la densità dei vasi in vivo, i processi essenziali di trasporto biologici possono essere replicati in questi costrutti, portando a più accurata modellazione in vitro di farmacocinetica di droga e la malattia.
Introduction
Il sistema vascolare, composto sia linfatico e cardiovasculature, forme reti ad alta densità che sono essenziali per il trasporto di nutrienti e ossigeno e per la rimozione dei rifiuti metabolici. Di conseguenza, le cellule residenti nei tessuti vascolarizzati sono mai più di 50-100 micron di distanza da un recipiente 1. La capacità di riprodurre in vivo dell'architettura vascolare in vitro è fondamentale per modellare accuratamente in vivo processi di trasporto utilizzando costrutti ingegnerizzati. Con una recente un'unità di sviluppare dispositivi organo-on-a-chip 2 per droga high-throughput di screening 3,4 e modellazione malattia 5,6, metodi per creare reti di microfluidica che ricapitolano in vivo -come trasporto in idrogel sintetici o naturali sono di disegno notevole interesse. Per migliorare la biomimicry di microtissues utilizzati in questi dispositivi, abbiamo sviluppato un metodo degrado idrogel laser-based guidata dalle immagini che utilizza tridimenspile l immagine (3D) di vascolarizzazione nativa come modelli per la generazione di reti microfluidica vascolari-derivati incorporati in PEGDA idrogel 7. Questo protocollo descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser disponibile in commercio equipaggiato con un laser pulsato a femtosecondi per fabbricare vascolari derivate, reti microfluidici biomimetiche in idrogel PEGDA tramite degradazione guidata dalle immagini, basato su laser.
Gli attuali approcci per fluidificare idrogel includono l'induzione di vascolare 8-10 o 10-12 tecniche delle cellule endoteliali di auto-assemblaggio e di microfabbricazione angiogeniche di creare canali pre-definiti per endotelializzazione 13-16. Mentre le reti autoassemblati ricapitolano la densità e complessa architettura di microcircolo, spesso sono più permeabili reti in vivo 11,17,18, che può essere problematica nel trasporto modellazione per applicazioni di screening di stupefacenti. reti di auto-assemblati costituiti da physiologcamente rilevanti, vasi capillari di dimensioni, ma possono essere difficili da integrare con il flusso del fluido di massa a causa di limitazioni nella generazione di grandi vasi arteriole dimensioni. Poiché non vi è alcun controllo diretto sul gruppo di queste reti, l'architettura finale può variare da campione a campione, rendendo difficile ripetutamente produrre reti con le stesse proprietà di flusso e trasporto dei fluidi.
Per generare 3D, reti microfluidica idrogel-embedded a geometria ripetibile e architettura ben definito, sono state sviluppate una serie di tecniche di microfabbricazione, compreso il montaggio modulare 13, la stampa 3D di materiali sacrificali 16, montaggio e scrittura diretta 14, e la stampa omnidirezionale 15. L'applicazione di questi metodi, architettura microfluidica, e quindi fluidi proprietà di scorrimento e di trasporto, può essere ripetutamente fabbricato in molti costrutti. Una limitazione importante di questi approcci, tuttavia, è l'incapacità di creare microFreti luidic con caratteristiche capillari di dimensioni, da 4 a 10 micron 19. La maggior parte delle tecniche di microfabbricazione sono spesso limitati alle funzioni da 150 a 650 micron di diametro 13,16. Alcune tecniche esistenti sono in grado di generare reti gerarchiche con canali in una vasta gamma di diametri, 10 e 300 micron per il montaggio-scrittura diretta 14, e da 18 a 600 _M per la stampa omnidirezionale 15, ma sono limitati nella loro capacità di generare reti dense o per produrre più reti microfluidica in prossimità all'interno di un unico costrutto 7.
Per superare alcune di queste limitazioni, abbiamo sviluppato una tecnica degrado idrogel laser-based guidata dalle immagini che permette la fabbricazione ripetibile di biomimetica, reti microfluidica gerarchiche che ricapitolano l'architettura del microcircolo in vivo. Per fare ciò, un 790 nm, 140 femtosecondi (fs) laser pulsato operante a 80 MHz è i raster scansionatan desiderata posizioni 3D all'interno di un idrogel, come definito da immagini di vascolarizzazione in vivo. Noi ipotizziamo che il processo di degradazione opera attraverso la ripartizione indotta da laser ottica di acqua, la formazione di plasma risultante, la successiva rapida espansione termoelastica di acqua, e la degradazione locale del idrogel come l'acqua si espande 20. Questo meccanismo varia leggermente dalla degradazione basato su laser di idrogel a base di proteine 21-24. Diversamente PEGDA, che ha una bassa sezione multiphoton, proteine hanno spesso una grande multiphoton sezione e sono quindi degradati attraverso un multiphoton assorbimento indotta rottura chimica 23. Per generare reti microfluidica guidate da immagini, l'otturatore laser è controllato da maschere virtuali immagine derivato, che consistono di un mosaico di regioni di interesse 9 che definiscono l'architettura microfluidica. Usando questo approccio, abbiamo dimostrato la capacità di fabbricare microfluidi biomimetico vascolare-derivati 3Dreti ic, che ricapitolano l'architettura densa e tortuoso vascolare in vivo, per controllare localmente la porosità degli idrogel alterando la quantità di energia erogata durante la degradazione. Siamo stati anche in grado di generare due reti microfluidica indipendenti che si intrecciano nelle immediate vicinanze (15 micron), ma non si collegano direttamente 7. Abbiamo inoltre dimostrato la capacità di endothelialize microcanali laser degradata attraverso posta degrado funzionalizzazione con l'integrina leganti sequenza peptidica, arginina-glicina-acido aspartico-Serina (RGDS), per favorire l'adesione delle cellule endoteliali e la formazione di lumen 7.
Con questo protocollo, la generazione di reti complesse microfluidica in idrogel PEGDA è reso possibile tramite la degradazione guidata dalle immagini, laser-based utilizzando un microscopio disponibile in commercio accessibile su molti campus universitari. Poiché il processo di degradazione è guidato da, maschere virtuali digitali, questa fabricatecnica zione è suscettibile per la progettazione creativa di reti microfluidica, consentendone l'uso in un'ampia varietà di applicazioni. Prevediamo che il metodo descritto qui sarà più vantaggiosa nella progettazione di dispositivi organismi e umane-on-a-chip biomimetici in grado di replicare i processi di trasporto biologici importanti nella modellazione del trasporto di droga 2. Questa tecnica di fabbricazione può anche essere di interesse per la generazione di modelli di malattia in vitro, comprendenti metastasi del cancro 5,6 e modelli barriera ematoencefalica 25. Come degrado idrogel basato su laser è stato precedentemente utilizzato per creare tracce per la guida di escrescenza neuronale 21-23, l'estensione guidata dalle immagini di questa tecnica potrebbe rivelarsi utile nelle strategie di ingegneria tessutale avanzate per posizionare le celle a disposizioni spaziali 3D definiti dall'utente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Critiche nella ignorando le funzioni standard del software microscopio per consentire l'utilizzo di maschere virtuali per la degradazione guidata dalle immagini, basata sul laser, la macro microscopio deve essere messa a punto e manipolato con cura. Come le interfacce software microscopio con la macro microscopio a volte può essere controintuitivo, e molti sforzi sono stati investiti nel determinare le impostazioni ottimali in entrambi i programmi per sviluppare questo metodo. Si consiglia una comprensione generale del laser-scanning di base uso microscopio confocale, in particolare con la "Stage" e le finestre "FOCUS" per la ricerca e il posizionamento del idrogel nelle direzioni x, y, z e dimensioni, prima di tentare la degradazione basato sul laser in modo corretto. Inoltre, la fabbricazione di un canale di ingresso è fondamentale per il protocollo; specie fluorescenti sospese dovranno essere in grado di immettere i sistemi microfluidici per l'imaging di successo e caratterizzazione di rete. È importante notare che questo protocollo si applica a una determinata al laserscansione microscopio confocale configurato con uno specifico laser pulsato a femtosecondi, in esecuzione versioni specifiche del software del microscopio e il microscopio macro (vedi dettagli nella lista delle specifiche Materiali / Equipment). Abbiamo scoperto che le versioni più recenti del macro microscopio non hanno il controllo e la funzionalità necessarie necessarie per il controllo del laser guidata dalle immagini. Mentre altre piattaforme microscopio e sorgenti laser ad impulsi può essere utilizzato, questo protocollo si applica specificamente a questo sistema e dovrà modifica secondo la piattaforma, sorgente laser e software implementato. I principi alla base di tutto questo protocollo si applicano ancora, però.
Un potenziale modifica di questo protocollo comporta la modifica della composizione idrogel. Qui, abbiamo utilizzato 5% in peso, 3,4 idrogel kDa PEGDA, ma il degrado basato su laser (per scopi di parte generazione di rete microfluidica) è stato implementato per degradare sia idrogel sintetici e naturali, tra cui PEGylated fibrinaOgen 21,22, proteine della seta idrogeli 23, e collagene 24. La regolazione della potenza del laser, velocità di scansione, spaziatura tra Z-fette, e il numero di ripetizioni sarà di aiuto nel determinare i parametri ottimali per fabbricare reti microfluidici in altre formulazioni idrogel.
Una corrente di limitazione della tecnica è il volume complessivo di idrogel che può essere degradato in una quantità di tempo fattibile. Per creare vuoti aperti o caratteristiche microfluidica all'interno del idrogel, il laser tempo di sosta deve essere pari o superiore a 8,96 ms / pixel (o di una velocità di scansione laser di 0,021 micron / ms) quando si utilizza una fluenza laser di 37,7 nJ / micron 2. Con queste impostazioni, ci vogliono 1,4 h di degradare vasi all'interno di un volume 0,014 millimetri 3 (come si vede in figura 1). Utilizzando un tempo di sosta laser di 4.48 ms / pixel o inferiore, l'energia erogata non è sufficiente per la piena degradazione della formulazione idrogel usato qui. L'implementazione di un idrogel diversocomposizione potrebbe superare questa limitazione. L'uso di gel fotolabili che contengono componenti sensibili alla luce 34-36 o idrogel che hanno grandi multiphoton sezioni 21-24 sono buone opzioni che permetta l'utilizzo di meno energia e si tradurrebbe in precoce decadimento. Per quanto riguarda le limitazioni dimensionali, caratteristiche sono state fabbricate fino a 1,5 mm di profondità in idrogel 7. Il ottenibile profondità è una funzione della distanza di lavoro dell'obiettivo e può essere aumentata utilizzando obiettivi a distanza di lavoro ultra-lunghi ottimizzati per imaging in vivo. Il più piccolo canale misurata 7 creata usando un 20X (NA1.0) obiettivo ad immersione acqua aveva una larghezza di 3,3 micron e profondità di 8,9 micron, che è alla pari con le dimensioni più piccole canali generati in Figura 1. Mentre altri laboratori hanno utilizzato inferiori obiettivi NA 21,23,24, ci aspettiamo che le reti microfluidica con caratteristiche più piccoli possono essere generati utilizzando altaobiettivi er NA a scapito di una distanza di lavoro ridotta. Infine, tuttavia, la risoluzione della tecnica è una funzione della funzione di diffusione di punto del fascio laser focalizzato, le proprietà di scansione laser, la quantità di energia erogata dal laser, e le proprietà di assorbimento del laser del materiale degradati.
Inoltre, le proprietà laser (velocità, fluenza, la spaziatura tra le maschere virtuali, ed il numero di ripetizioni) devono essere ottimizzate in base alle proprietà idrogel (densità di reticolazione, macromero / peso molecolare del monomero, percento in peso ed il tipo di idrogel: proteina a base sintetica vs. ), in quanto questi intrinsecamente alterare le interazioni con il laser e quindi la soluzione finale del processo. Mentre l'energia erogata è influenzata anche dall'obiettivo utilizzato, l'ottimizzazione aggiuntivo è necessario quando si passa tra gli obiettivi. Per quanto riguarda i costi, è necessario accedere ad un microscopio con un laser pulsato, e mentre molti objec diversitive possono essere usati, quelli con un alto NA e distanza di lavoro (per imaging in vivo) può essere costoso.
Al di là del protocollo dettagliato qui, reti microfluidica generati con questa tecnica possono essere funzionalizzati con peptidi cellula-adesivo post-channel fabbricazione di indurre l'adesione delle cellule endoteliali e la formazione di lumen 7. Inoltre, l'incorporazione di sequenze peptidiche cellule degradabile nel materiale sfuso 9 prima incanalare degrado potrebbe consentire lo studio della migrazione cellulare in e attraverso l'idrogel. Per fluidizzazione continua della rete microfluidica all'interno dell'idrogel, idrogel possono essere photopolymerized in dispositivi o contenitori fluidici più grandi, come dimostrato nelle figure 2 e 3 7.
La generazione di reti vascolari via vascolare o angiogenico autoassemblaggio 8-12 fornisce un approccio diretto per indurre vascularization durante un volume relativamente grande idrogel. Sebbene questo approccio si traduce in reti fluidici perfusable, è difficile controllare direttamente le dimensioni, tortuosità, densità e architettura di rete complessiva. A causa di questa limitazione, il profilo di flusso e velocità di taglio nella vascolatura possono variare tra esperimenti. In alternativa, le tecniche di microfabbricazione 13-16 consentono il controllo diretto sulle architetture di rete, ma sono spesso limitate dalla loro incapacità di generare piccoli, canali capillari dimensioni o la realizzazione di reti dense che imitano in architettura vivo vascolare. Mentre la tecnica di degrado idrogel basato su laser qui delineato è stato recentemente riproposto per la generazione di microfluidica, supera contemporaneamente sia il controllo architettonico e limitazioni di dimensione basata su metodi di microfabbricazione esistenti, consentendo la creazione di reti di microfluidica biomimetici 3D che ricapitolano la densità, tortuosità, gamma di dimensioni, e nel complesso architecture di vascolarizzazione in vivo. Inoltre, più reti fluidici possono essere generati in una singola idrogel, permettendo lo studio dei trasporti inter-rete 7. Per le applicazioni di ingegneria tissutale che si sforzano di replicare più da vicino in processi di trasporto in vivo in vitro, le reti microfluidica idrogel-embedded altamente risolti qui descritte sono adatte. Prevediamo che questo protocollo sarà utile per lo sviluppo di costrutti di tessuto che più accuratamente imitare il trasporto in vivo per l'utilizzo come dispositivi di screening di stupefacenti e in modelli di malattia in vitro.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
Materials
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
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