guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas
Summary
This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Abstract
Este protocolo detalhado descreve a aplicação de guiada por imagem, a degradação do hidrogel à base de laser para a fabricação de redes de microfluidos derivada-vasculares incorporados em hidrogéis PEGDA. Aqui, descrevemos a criação de máscaras virtuais que permitem o controle do laser guiada por imagem; a fotopolimerização de um hidrogel PEGDA micromolded, adequadas ao fabrico de rede microfluídicos e fluxo orientado a cabeça de pressão; a instalação e utilização de um laser scanning microscópio confocal comercialmente disponível emparelhado com um pulsada Ti femtosecond: Laser S para induzir a degradação de hidrogel; ea imagem das redes microfluídicos fabricados com espécies fluorescentes e microscopia confocal. Grande parte do protocolo está focado na configuração adequada e implementação do software microscópio e microscópio macro, já que esses são passos fundamentais para usando um microscópio comercial para fins de fabricação microfluídicos que contêm uma série de complexidades. O componente guiada por imagem desta technique permite a implementação de pilhas de imagens 3D ou modelos 3D gerados pelo usuário, permitindo assim para o projeto microfluídico criativo e para a fabricação de sistemas microfluídicos complexos de praticamente qualquer configuração. Com um impacto esperado na engenharia de tecidos, os métodos descritos neste protocolo pode ajudar na fabricação de construções microtissue biomiméticos avançados para dispositivos zações e humanos-on-a-chip. Imitando a arquitectura complexa, tortuosidade, o tamanho e densidade dos vasos in vivo, os processos biológicos essenciais de transporte pode ser replicado nestas construções, levando a modelação mais precisa farmacocinética in vitro de droga e doença.
Introduction
O sistema vascular, que consiste em ambos linfático e cardiovasculature, formas redes altamente densos que são essenciais para o transporte de nutrientes e de oxigénio e para a remoção de resíduos metabólicos. Por conseguinte, as células residentes nos tecidos vascularizados são nunca mais do que 50-100 uM de distância a partir de um recipiente 1. A capacidade de reproduzir in vivo arquitetura vascular in vitro é crítica para modelar com precisão in vivo de processos de transporte que utilizam construções de engenharia. Com uma movimentação recente para desenvolver dispositivos de órgãos-on-a-chip 2 para medicamentos de alto rendimento de triagem 3,4 e modelagem de doença 5,6, métodos para criar redes microfluídicos que recapitulam o transporte in vivo -como em hidrogéis sintéticos ou naturais são desenho interesse significativo. Para melhorar a biomimética de microtissues utilizados nestes dispositivos, desenvolvemos, um método de degradação do hidrogel à base de laser guiada por imagem que utiliza tridimensional ocapilhas l de imagem (3D) da vasculatura nativa como modelos para gerar redes microfluídicos derivados do vasculares embutidos em PEGDA hidrogéis 7. Este protocolo descreve o uso de um microscópio confocal de varrimento laser disponível comercialmente equipada com um laser pulsado femtosegundo para fabricar, redes de microfluidos biomiméticos derivada-vasculares em hidrogeles através da degradação da PEGDA guiada por imagem, à base de laser.
As abordagens atuais para fluidificar hidrogéis incluem a indução de vasculogenic 8-10 ou técnicas de automontagem 10-12 células endoteliais e microfabricação angiogénicos para criar canais pré-definidos para endotelização 13-16. Embora as redes de auto-montados recapitular a densidade e arquitetura complexa de microvasculatura, eles são muitas vezes mais permeável do que in vivo redes 11,17,18, o que pode ser problemático em transporte de modelagem para aplicações de rastreio de drogas. redes auto-organizadas consistem em physiologcamente relevante, vasos capilares porte-, mas eles podem ser difíceis de integrar com o fluxo de fluido em massa devido às limitações na geração de navios de porte arteríolas maiores. Como não há controle direto sobre o conjunto dessas redes, a arquitetura final pode variar de amostra para amostra, o que torna difícil para produzir repetidamente redes com as mesmas propriedades de fluxo e transporte de fluidos.
Para gerar 3D, redes microfluídicos embebidos em hidrogel com geometria repetível e arquitetura bem definida, uma série de técnicas de microfabricação foram desenvolvidas, incluindo a montagem modular 13, a impressão 3D de materiais sacrificiais 16, montagem e gravação direta 14 e impressão omnidirecional 15. Aplicando estes métodos, arquitetura microfluídico, e propriedades de fluxo e de transporte, portanto, fluidos, podem ser repetidamente fabricados através de muitas construções. Uma das principais limitações destas abordagens, no entanto, é a incapacidade de criar MICROFluidic redes capilares com características de tamanho, 4-a 10 uM 19. A maioria das técnicas de microfabricação são muitas vezes limitados a funcionalidades variando de 150 a 650 mícrons de diâmetro 13,16. Algumas técnicas existentes são capazes de gerar redes hierárquicos com canais em toda uma gama de diâmetros de largura e 10 a 300 um para a montagem e escrita directa 14, e 18 a 600 um para a impressão omnidireccional 15, mas eles são limitados na sua capacidade para gerar redes densas ou para produzir várias redes microfluídicos nas proximidades dentro de uma única construção 7.
Para superar algumas destas limitações, desenvolvemos, uma técnica de degradação hidrogel à base de laser guiada por imagem que permite a fabricação repetitiva de biomimética, redes microfluídicos hierárquicas que recapitulam a arquitetura da microcirculação in vivo. Para isso, a 790 nm, 140 femtossegundos (fs) laser pulsado operando a 80 MHz é digitalizada-raster in desejado locais 3D dentro de um hidrogel, tal como definido por imagens da vasculatura in vivo. Especula-se que o processo de degradação opera através do colapso induzido por laser óptico de água, a formação de plasma resultante, o subsequente expansão termoelástica rápida de água, e a degradação do local do hidrogel como a água se expande 20. Este mecanismo varia ligeiramente de degradação à base de laser de hidrogeles à base de proteína de 21-24. Ao contrário PEGDA, que tem uma secção transversal multifotônica baixo, proteínas, muitas vezes têm uma grande secção transversal multifotônica e, portanto, são degradados através de uma multifotônica induzida por absorção química ruptura 23. Para gerar redes de microfluidos guiada por imagem, o obturador de laser é controlado por máscaras virtuais derivado de imagem, que consistem de um mosaico de regiões de interesse 9 que definem a arquitectura de microfluidos. Usando essa abordagem, nós demonstramos a capacidade de fabricar MICROFLUID biomimético derivada-vascular 3Dredes ic, que recapitulam a arquitectura densa e tortuoso da vasculatura, in vivo, a fim de controlar localmente a porosidade de hidrogéis, alterando a quantidade de energia fornecida durante a degradação. Nós também foram capazes de gerar duas redes microfluídicos independentes que se entrelaçam na proximidade (15 mm), mas nunca se conectam diretamente 7. Nós também demonstraram a capacidade de endothelialize microcanais laser de pós degradada através de degradação funcionalização com a sequência do péptido de ligação de integrina, Arginina-Glicina-Ácido aspártico-serina (RGDS), para promover a adesão de células endoteliais e formação de lúmen 7.
Com este protocolo, a geração de redes complexas microfluídicos em hidrogéis PEGDA é possível através da degradação guiada por imagem, baseada em laser usando um microscópio disponível comercialmente acessível em muitos campi universitários. À medida que o processo de degradação é guiado por virtuais, máscaras digitais, esta Fabricação técnica é favorável para a criação de redes de microfluidos criativo, permitindo o seu uso numa grande variedade de aplicações. Prevemos que o método descrito aqui será mais vantajosa em projetar dispositivos zações e humanos-on-a-chip biomiméticos capazes de replicar processos de transporte biológicas importantes na modelagem de transporte da droga 2. Esta técnica de fabricação podem também ser de interesse para a geração de modelos de doenças in vitro, incluindo metástases do cancro 5,6 e modelos barreira hemato-encefálica 25. Como a degradação hidrogel à base de laser tenha sido previamente utilizado para criar faixas para a orientação de crescimento neuronal 21-23, a extensão guiada por imagem desta técnica poderia ser útil em estratégias avançadas de engenharia de tecidos para posicionar células em arranjos espaciais em 3D definidos pelo usuário.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crítica em substituir as funções padrão do software microscópio para permitir o uso de máscaras virtuais para a degradação guiada por imagem, baseada em laser, a macro microscópio deve ser configurado e manipulada com cuidado. Como as interfaces de software microscópio com a macro microscópio pode às vezes ser contra-intuitivo, e muito esforço foi investido em determinar os melhores ajustes em ambos os programas para desenvolver este método. A compreensão geral de laser de digitalização básica uso de microscópio confocal é recomendado, especialmente com o "Stage" e janelas "Focus" para encontrar e corretamente posicionando o hidrogel nos x, y, e z dimensões, antes de tentar a degradação à base de laser. Além disso, a fabricação de um canal de entrada é crítica para o protocolo; espécies fluorescentes suspenso deve ser capaz de entrar nos sistemas de microfluido para a imagiologia bem sucedida e caracterização de rede. É importante notar que este protocolo se aplica a uma específica Laser-digitalização microscópio confocal configurado com um laser pulsado femtosecond específico, executando versões específicas do software microscópio e a macro microscópio (ver detalhes na Lista de materiais específicos / Equipamentos). Nós descobrimos que as versões mais recentes do macro microscópio falta de controle e funcionalidade necessária necessária para controle do laser guiada por imagem. Enquanto outras plataformas de microscópio e fontes de laser pulsado pode ser usado, este protocolo aplica-se especificamente a este sistema e terá a modificação de acordo com a plataforma, fonte de laser e software implementado. Os princípios subjacentes a todo este protocolo ainda se aplicam, no entanto.
Uma modificação potencial para este protocolo envolve a alteração da composição de hidrogel. Aqui, utilizou-se 5% em peso, 3,4 hidrogéis PEGDA kDa, mas a degradação à base de laser (para fins de geração de lado da rede de microfluidos) foi implementada para degradar ambos os hidrogeles sintéticos e naturais, incluindo fibrina PEGuiladoog�io 21,22, proteína de seda hidrogéis 23, e colágeno 24. Ajuste da potência do laser, velocidade de digitalização, espaçamento entre Z-fatias, eo número de repetições ajudarão a determinar os parâmetros ótimos para fabricar redes microfluídicos em outras formulações de hidrogel.
Uma limitação de corrente da técnica é o volume total do hidrogel que pode ser degradado em uma quantidade de tempo possível. Para criar vazios abertos ou recursos microfluídicos dentro do hidrogel, o laser tempo de permanência deve ser igual ou superior a 8,96 uS / pixel (ou uma velocidade de digitalização de laser de 0,021 mm / ms) ao usar uma fluência do laser de 37,7 nJ / mm 2. Com estas definições, leva-se 1,4 h a degradar vasos dentro de um volume de 0,014 milímetros 3 (como visto na Figura 1). Usando um tempo de permanência de laser de 4,48 mS / pixel ou abaixo, a energia entregue não é suficiente para a completa degradação da formulação de hidrogel aqui utilizado. A implementação de um hidrogel diferentecomposição poderia superar essa limitação. O uso de géis fotolabilidade que contêm componentes sensíveis à luz 34-36 ou hidrogéis que têm grande multifotônica secções transversais 21-24 são boas opções que permitam a utilização de menos energia e resultaria em degradação mais rápida. No que diz respeito às limitações dimensionais, características têm sido fabricados até 1,5 mm de profundidade no hidrogel 7. O realizáveis profundidade é uma função da distância de trabalho do objectivo e pode ser aumentada usando objetivos distância de trabalho ultra-longos otimizados para imagiologia in vivo. O canal de medida menor 7 criado usando um 20X (NA1.0) objectiva de imersão em água tinha uma largura de 3,3 mm e profundidade de 8,9 mm, o que está a par com o tamanho das menores canais gerados na Figura 1. Enquanto outros laboratórios têm usado objetivos NA inferiores 21,23,24, prevemos que as redes microfluídicos com pequenos recursos podem ser gerados usando altaobjetivos er NA à custa de uma distância de trabalho reduzida. Em última análise, no entanto, a resolução da técnica é uma função da função de dispersão do feixe de laser focado, as propriedades de rastreio por laser, a quantidade de energia fornecida pelo laser, e as propriedades de absorção de laser do material a ser degradada.
Além disso, as propriedades de laser (velocidade, fluência, espaçamento entre máscaras virtuais e número de repetições) deve ser otimizado com base nas propriedades de hidrogel (densidade de ligações cruzadas, macrómero / peso molecular de monómeros, por cento em peso e tipo de hidrogel: à base de proteína sintética vs. ), uma vez que estes serão inerentemente alterar as interacções com o laser e, assim, a resolução final do processo. À medida que a energia fornecida é também influenciada pelo objectivo utilizado, a optimização adicional é necessário quando se alterna entre objectivos. No que diz respeito aos custos envolvidos, o acesso a um microscópio com um laser pulsado é necessário, e enquanto muitos objec diferentetivos podem ser utilizados, aqueles com uma elevada NA e longa distância de trabalho (por imagiologia in vivo) pode ser caro.
Para além do protocolo detalhado aqui, redes de microfluidos geradas utilizando esta técnica também pode ser funcionalizada com péptidos de células-adesivo pós-fabricação de canal para induzir a adesão de células endoteliais e formação de lúmen 7. Além disso, a incorporação de sequências de péptidos de células-degradável no material a granel 9 antes para canalizar degradação poderia permitir o estudo de migração celular para dentro e através do hidrogel. Para fluidização contínua da rede de microfluidos dentro do hidrogel, os hidrogéis são polimerizáveis em dispositivos fluídicos ou caixas maiores, como demonstrado nas Figuras 2 e 3 7.
A geração de redes vasculares via vasculogenic ou angiogênico auto-montagem 8-12 fornece uma abordagem simples para induzir vascularization ao longo de um volume relativamente grande de hidrogel. Embora esta abordagem resulta em redes fluídicos perfusable, é difícil de controlar diretamente o tamanho, tortuosidade, densidade e arquitetura de rede geral. Devido a esta limitação, o perfil de escoamento e as taxas de cisalhamento na vasculatura pode ser diferente entre as experiências. Alternativamente, técnicas de microfabricação 13-16 permitir controle direto sobre arquitetura de rede, mas são muitas vezes limitadas pela sua incapacidade para gerar canais pequenos, do tamanho de capilares ou a fabricação de redes densas que imitam na arquitetura vivo vascular. Embora a técnica degradação hidrogel à base de laser descrito aqui foi recentemente reaproveitado para a geração de microfluidos, simultaneamente supera tanto o controle arquitetônico e limitações à base de tamanho dos métodos de microfabricação existentes, permitindo a criação de 3D redes microfluídicos biomiméticos que recapitulam a densidade, tortuosidade, faixa de tamanho, e architectur gerale da vascularização in vivo. Além disso, várias redes de fluidos pode ser gerado num hidrogel, permitindo o estudo do transporte inter-rede 7. Para aplicações de engenharia de tecidos que se esforçam para replicar de forma mais estreita em processos de transporte in vivo, in vitro, as redes microfluídicos incorporado-hidrogel altamente resolvidas aqui descritos são adequados. Prevemos que este protocolo será útil no desenvolvimento de construções de tecido que o transporte de forma mais precisa imitar in vivo para uso como dispositivos de detecção de drogas e em modelos de doenças in vitro.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
Materials
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
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