血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

1.仮想マスクを作成注：マウス脳微小血管系の3D画像スタックは、このプロトコルのためのマイクロ流体モデルとして選ばれた全体マウス脳微小血管系の画像を含むはるかに大きなデータセットから抜粋されました。微小血管の画像は、ナイフエッジの走査顕微鏡（KESM）26、2を介して取得しました。同様の微小血管のデータがKESMマウス脳アトラス28を介して公然と入手できます。 （Zによってyでx）は450ミクロンのx 450μmのX 1.5ミリメートルに収まる、画像処理ソフトウェア29を開き、開いた、希望のマイクロ流体ネットワークは、ヒドロゲル内で生成されるように、ネイティブ血管系の3D TIFの画像スタックをトリミング窓。これを行うには、所望の領域の周囲に四角形を描画し、「イメージ」→「トリミング」をクリックします。所望のスライスに「画像」→「重複」とタイプをクリックすることにより、z方向のスライスを削除します範囲。 注：これは（yでx）の所望の特徴は、視野内に収まることを保証します（531.2 X 531.2μmで2884 X 2884ピクセルのフレームサイズと0.8のズームと20X（NA1.0）水浸対物レンズを使用した場合レーザー走査型共焦点顕微鏡）および20X（NA1.0）水浸対物レンズの作動距離（Z）。未知の場合は、他のシステムの視野は、所望の目的と設定で画像を取得することによって決定することができます。 機能は主にラスタースキャン、またはx方向の方向と一致している、「イメージ」をクリックして→→「回転」「変換」するように画像スタックを回転させます。これは、製造に必要な時間を減少させます。 画素サイズが一致するかは、共焦点顕微鏡で分解のために使用される設定（0.184ミクロン/ピクセル2884ピクセルによって2884のフレームサイズと20X（NA1.0）水浸対物レンズを使用して超えるようにトリミングされた画像スタックを拡大縮小および0.8のズーム）。これを行うには、「イメージ」をクリック→→「サイズ」を「調整」と「幅」（ すなわち、450ミクロン、または0.184ミクロン/ピクセルによって分割された画像の大きさ）は、「2446」を入力します。 しきい値/「Ctrlキー+ Shiftキー+ T」を入力することで画像スタックを2値化。 「暗い背景」を選択解除して、→「OK」「適用」をクリックします。 「イメージ」→「ルックアップテーブル」→「反転LUT」をクリックしてプロセスを完了します。 カスタム・アルゴリズムを使用して、X（ラスタ走査の方向に平行な二値（白）フィット単一の画素高四辺形のモザイクと特徴、プログラミングソフトウェア9（ソースコードは、参照原稿の補足資料で利用可能です）方向）<関心領域のレーザ位置およびシャッター9、7、30、31を導く（関心領域） を生成しますSUP> 32。 注：カスタムアルゴリズム9は、RLSファイルにTIFの画像スタック内の個々の平面に変換します。 分解中に使用するために.OVLするRLSファイルのファイル拡張子を変更します。 2.レーザー走査型共焦点顕微鏡の構成注：パルスレーザを備えた他のレーザ走査型顕微鏡を使用することができるが、ここでの設定およびプロトコルは、そのソフトウエアと組み合わせてレーザー走査顕微鏡（LSM）の使用を記載しています。 上のレーザー走査共焦点顕微鏡では、顕微鏡ソフトウェアを開き、クリックして "スタートシステム」を「メンテナンス」タブで客観「Wプラン – アポクロマート20X / 1.0 DIC VIS-IR M27 75ミリメートル」を選択します。 「ヒドロゲルの可視化」のコンフィギュレーション設定 「取得」タブでは、レーザ線（514nmのアルゴンレーザー）は「レーザー」windoで選択し、オンされていることを確認ワット注：このチャネルは、オリエンテーションの目的の7のためのエオシンYの蛍光を介したハイドロゲル画像に使用されます。 「イメージングの設定」ウィンドウで、「フレーム」に「すべてのトラックの切り替え」、および「トラック1」を選択し、「チャネルモード」は、「モード」に設定します。 「光パス」ウィンドウでは、516 nmの735までの範囲で、唯一のCh1の蛍光検出器を選択します。メインビームスプリッタ（MBS）の可視光回線上の514分の458フィルター;そして、不可視光のラインでプレート。明視野光電子増倍管検出器、「T-PMT」を選択解除します。 「取得モード」ウィンドウで、正しい目的が選択されていることを確認し、XとYに「2884」に「フレーム」を「スキャンモード」、「フレームサイズ」を設定し、「ラインステップ」を「1」 「平均」に「ライン」、「平均化方法」に「1」、「平均化モード」、「平均化回数」、「ビット深度」を「16ビット」、および「方向」を「 – 双方向走査のために、「<>。 所望のように「取得モード」ウィンドウで、「スピード」を設定し、 "0.05"に "コアーX」と「Y」に設定するか、または使用されている特定の顕微鏡の必要に応じて調整してください。 「HDR」を選択解除します。 「取得モード」ウィンドウで、「ズーム」が「0.8」に設定すると、「スキャン領域」は、「531.2ミクロンのx 531.2ミクロン」と「0.18」の「ピクセルサイズ」の「画像サイズ」が表示されていることを確認;ゼロに他のすべての「スキャン領域」の値を設定します。 「チャンネル」ウィンドウで、Ch1の蛍光検出器として「トラック1」を選択します。 "800"の「10.0」のパーセントパワーで選択レーザーライン「514」、「1AU」の「ピンホール」、最初の「ゲイン（マスター） "、" 0 "から"デジタルオフセット」、および「デジタル・ゲイン」の4; 1 "。 注：特定の顕微鏡用必要に応じてこれらの設定を調整し、使用されています。 「ハイドロゲル可視化」として、この設定を保存します。 「チャネル形成」のコンフィギュレーション設定 「レーザー」ウィンドウ内に選択されていると：「取得」タブでは、レーザーライン（SレーザーのTiパルス化790nmの140フェムト秒）がいることを確認してください。 790 nmでの最大電力出力のために、「4000」から「GDD補正」を設定します。 ステップ2.2.2で概説したように「イメージングの設定」ウィンドウを設定します。 「光パス」ウィンドウでは、可視光のライン上のMBS 458/514/561/633フィルタと不可視光回線上のMBS 760+フィルターで、何の蛍光検出器が選択されていないことを確認してください。明視野光電子増倍管検出器、「T-PMT」を選択解除します。 「取得モード」ウィンドウで、正しい目的がリストされていることを確認。 3 "に"スピード "を設定「ステップ2.2.4で概説されるように他のすべての設定。 「チャンネル」ウィンドウでは、T-PMT検出器として「トラック1」を選択します。 「800」の「100.0」、最初の「ゲイン（マスター）」のパーセントパワーのレーザライン「790」を選択し、「0」から「デジタルオフセット」、「1」の「デジタルゲイン」 。 「ステージ」ウィンドウで、「ゼロを設定する」をクリックするだけでステージをゼロ。 「マーク」をクリックすることで、位置をマーク。これは、ステップ3で、顕微鏡マクロに仮想のマスクをアップロードするために重要です。 「時系列」ウィンドウで、「0」として「1」と「間隔」と「サイクル」に設定します。 「ブリーチ」ウィンドウで、「スタート漂白＃スキャンの後に "チェックボックスをオンにして、「1の0」の値に設定します。 「3」（8.96マイクロ秒/ピクセルの画素滞留時間に相当）の値で、「異なるスキャン速度」を選択します。 「安全なBLを選択GaAsPのための各 "。 「ブリーチ」ウィンドウのレーザー線区間では、790レーザーラインを選択し、「100.0」パーセントの電力を設定します。選択されていない漂白ウィンドウ内のすべての他のボックスのままにしておきます。 「ブリーチ」ウィンドウで漂白設定を保存します。 「チャネル形成」として、この設定を保存します。 注：「Z-スタック」、「地域」、「フォーカス」、および「ステージ」ウィンドウもこのプロトコルにとって重要であるが、初期設定時に設定または調整する必要はありません。 3.レシピを作成し、顕微鏡ソフトウェアおよびマクロへの仮想マスクをアップロード 「チャネル形成」構成でまだ実行されているレーザー走査共焦点顕微鏡、まだ上の顕微鏡ソフトウェア、選択します（次の「実験を開始する」ボタンへ）のみ「リージョン」ウィンドウで。 マスクが正しい顕微鏡マクロにロードすることを確認するために、LY、「8」に「取得モード」ウィンドウで「0.2」から「チャンネル」ウィンドウと「速度」にパーセントのパワーを設定し、画面の左上にある「スナップ」をクリックします。 画像の「情報」タブで、「0.18」のピクセルサイズで、画像サイズは「531.2ミクロンのx 531.2μmのは "まだであることを確認してください。これらの値が正しくない場合は、もう一度「フレームサイズ」と「ズーム」の値を確認してください。 CRITICAL：「ステージ」ウィンドウで、XとYの位置をゼロしていること、および位置は、顕微鏡のマクロを開く前にマークされていることを確認してください。 2.3.6ステップを参照してください。 顕微鏡マクロ、タイプ「Altキー+ F8」を開くには、「ロード」をクリックして、正しいバージョンを選択します。具体的な材料/機器のリストで詳細を参照してください。サブマクロの長いリストは、「マクロ・コントロール」ウィンドウで開きます。 「マクロコントロール」ウィンドウで、MICRを開くには、「ファイル名を指定して実行」をクリックしますマクロOSCOPEし、「マクロ・コントロール」ウィンドウを閉じます。 注：顕微鏡マクロの代替バージョンでは、このプロトコルを使用してレーザーベースのヒドロゲル分解と互換性がない場合があります。 顕微鏡マクロの「保存」タブで、「単一ファイル出力」を選択し、任意の「ベースファイル名」を提供し、「一時ファイル」フォルダを選択しました。で、場所「1」に「オープンTEMPフォルダを「設定」シングル一時イメージフォルダ」を選択し、レシピに名前を選択し、「場所の一覧を思い出してください」と「店舗/レシピを適用します」。最初にレシピを作成するには、「ストア」をクリックしてください。 顕微鏡マクロの「取得」タブで、「スキャンの設定は、「ステップ2.3で設定された顕微鏡のソフトウェア構成に与えられた名前と一致することを確認。 「0」の「間隔」で、 "1"に "ブロック内の時間がないのポイント」を設定します。 Z STACのトップへ – "Zをマークすることを確認しますkが「緑の強調表示されている。彼らがそうであるように他のすべてのデフォルト設定は大丈夫です。 顕微鏡マクロの「タイミング」タブで、「遅延を待って」いることを確認し、緑色にハイライト "1"と "0" "最初の場所でブロックする前に待機間隔」に「実験繰返し」と「グループ繰り返し」に設定されています。他のすべてのデフォルト設定をそのまま罰金です。 注：「グループ繰り返し」（とない「実験繰返し」）1は、領域にわたって回レーザースキャンの数を設定することができボックスがある（ すなわち、レシピの繰り返し）。 顕微鏡マクロの「Zリスト」タブでは、z方向の劣化面が指定されています。使用する仮想マスクの数と一致するように設定された「ポジション数」と、「1ミクロン」に、「dZとする「Z-間隔を設定します。 「ドロップダウンリストに表示されるリチウムを「Zリスト」を作るために "Zスタックを作成」ボタンをクリックしてくださいウインドウの下部にある場所」のstが。場所とz間隔の数が正しいことを確認し、XとYの位置をゼロにしていること。 注：そうでない場合は、レシピを格納しません。顕微鏡マクロを閉じて、顕微鏡マクロを再度開いて、もう一度レシピを設定する前に、ステップ2.3.6を繰り返します。 注：顕微鏡マクロに個々のマスクをロードするようにする代わりに1ミクロンずつ離間100マスクを有することが、例えば、同等のマイクロ流体構造を得るために、それぞれが二回使用され、1マイクロメートル離れた、50のマスクを有することが有利であることができ時間がかかる可能。 顕微鏡マクロの「ブリーチ」タブでは、マスクのすべてがロードされなければならないと「場所のリスト」内の特定の番号の位置が一致しました。開始するには、「ブリーチ」ボックスを選択していることを確認し、「コンフィグ」。主顕微鏡ソフトウェアの画面で「ブリーチ」ウィンドウで漂白設定の名前と一致する（ステップ2を参照してください.3.8）。 "0"に「ブリーチ後の遅延を待ち "に設定し、「スポット」、および「ROI」空を残す選択を解除します。 「場所」、「タイル」、「グリッド」、「オートフォーカス」、「ブロック」、およびデフォルト設定から「オプション」タブには何も変更しないでください。 顕微鏡マクロにマスクをロードするには、顕微鏡ソフトウェアの唯一の「リージョン」ウィンドウを選択し、顕微鏡マクロの「ブリーチ」タブを開きます。 「リージョン」ウィンドウで、「読み込み」をクリックして、分解されzスタックの底にマスク用の.OVLファイルを選択します。 注：「Zリスト」の最初の場所は、zスタックの底であり、顕微鏡マクロは、zスタックの最上部、またはヒドロゲルにそのように動作します。 ROIのリストは、「リージョン」ウィンドウに表示されたら、（画像上にステップ3.2でスナップ）視野内にマスクののROIを表示するには、矢印ボタンをクリックします。 ROIは内に収まることを確認します視野。 その後、顕微鏡マクロにロードされたマスクを保存する「ブリーチ」タブの「ROIリストに現在のリージョンを追加」ボックスにマスクに名前と番号を与える、とするには、「ROIリストに現在のリージョンを追加」ボタンをクリックします。名前と番号は（他の以前に作成したレシピからマスクを含む）を、他のマスクで「ROI」ドロップダウンリストに表示されます。顕微鏡ソフトウェアの「リージョン」ウィンドウでマスクを削除します。 繰り返しは、顕微鏡マクロにすべてのマスクをアップロードして保存する3.14と3.16を繰り返します。 各Z-場所にアップロードされたマスクを割り当てるには、ドロップダウンリストの「場所の一覧」に位置1を強調表示します。 「ROI」ドロップダウンリストから適切なROIを選択します。 「ブリーチ」ボックスを顕微鏡マクロで「ブリーチ」タブの上部に選択されていることを確認。 その後、繰り返し「場所の一覧」ドロップダウン内の全ての位置のためのステップ3.18、および＆の「ストア」をクリック＃34;保存」タブでは、その最終的な形でレシピを保存します。 4. PEGDAヒドロゲルを光重合 トリエタノールアミン（TEOA）で滅菌HEPES緩衝生理食塩水（HBS）を作ります 1-Lのビーカーに、塩化ナトリウム2.922グラム、HEPESの1.196グラム、およびヒュームフード内TEOAの7.5ミリリットルを加えて混ぜる、撹拌棒を500ミリリットルのDI H 2 Oを追加します。 パスツールピペットで滴下することにより、1 N水酸化ナトリウム溶液でpH 8.3に調整します。 滅菌フィルター500mLのオートクレーブしたガラス製メディアボトルに0.2μmの真空濾過カップを通して溶液。 4℃でアリコートとストア。 底部のうち20 mmの穴カットに特化した60 mmのペトリ皿にバッキングと両面接着剤のリングを取り付けます。接着リング上のバッキングを残して、ペトリ皿と接着剤との間から気泡を押し出します。 材料を準備します。合成された33 3を持参してください。4 kDaのPEGDA -80°Cの冷凍庫のうち、それが室温に到達することができます。ヒドロゲルを光重合前に、白色光源少なくとも15分をオンにします。 ヒュームフードでは、（エオシンY、光開始剤の露光を防止するために使用）箔で覆われ、2 mLの琥珀色の遠心分離管にTEOAとHBSの1 mLを加え。 DI H 2 OにY二ナトリウム塩エオシン1 mMと10μLを追加ドラフト内で、パスツールピペットでガラスビーカーに、1-ビニル-2-ピロリドン（NVP）の少量を抽出します。このボリューム、NVPのピペット3.5μLからHBS、TEOAと琥珀色の遠心管、およびエオシンYの中へ第二の箔で覆われ、2 mLの琥珀色の遠心管に3.4kDa PEGDA 10mgを追加（プレポリマー溶液の誤った光活性化を防止するために使用されます）。 PEGDAプレポリマー溶液w / vの5％Y、NVP液エオシン、HBS、TEOAの0.2 mLを加え。 PEGDAまで渦が完全に溶解します。電力計と検出器ワンドを使用して、白色のLiの強度を調整します95ミリワットにGHTソース。 ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）金型の構築 取り扱いを容易にするために、より大きな表面（ガラス、ポリスチレン組織培養皿）にPDMSモールド7を構築し、成形ヒドロゲルは20 mmの直径の円内に収まるように、金型を組み立てます。 厚さ500μmの矩形のヒドロゲルを生成するには、2つの定義されたヒドロゲルのエッジを作成するために、PDMSの表面上に2厚さ500μmのPDMSのスペーサーを配置します。 流体を導入するために有用であるハイドロゲルの表面に300μmの深井戸を付与する300μmのPDMSのスペーサーが含まれます。 PEGDAプレポリマー溶液w / vのPDMSモールドの上に5％のピペット60μL。ピペット操作中に気泡を導入しないように注意してください。 センターと配置[3-（メタクリロイルオキシを）プロピル]トリメトキシシラン（TMPSA）は、溶液の上に＃1.5カバーガラス、40 mmの直径7を官能。 coverslていることを確認してくださいipが500μmのPDMSスペーサー上に載っています。ヒドロゲルは、メタクリルカバースリップに結合し、溶液中に浮遊からヒドロゲルを防ぐことができます。 PDMS、PEGDAプレポリマー溶液を置き、3分間の白色光源下でのアセンブリをカバースリップ。 金型とPDMSからヒドロゲルを分離するためのカバーガラスとの間の流れのDI H 2 O。 DI H 2 Oでハイドロゲルをすすぐラボ組織でカバースリップの端を乾燥させます。ヒドロゲルから水を触れたり吸い上げないように注意してください。 接着剤からバッキングを除去した後、準備されたペトリ皿にカバースリップを接着し、静かに接着剤とガラスの間から気泡を除去。 DI H 2 Oでペトリ皿にヒドロゲルを水没注：PDMSモールドは、DI H 2 Oですすいだ場合に、追加のヒドロゲルを作製するために再利用し、窒素で乾燥し、埃のない保つことができます。 5.血管由来のマイクロ流体ネットワークを製作レーザーベースの分解を経由しての上のレーザー走査型共焦点顕微鏡と顕微鏡ソフトウェアを使用すると、「メンテナンス」タブで客観「Wプラン – アポクロマート20X / 1.0 DIC VIS-IR M27 75ミリメートル」を選択します。上にあり、ウォームアップ：「取得」タブで、必要なレーザーライン（Sレーザー514nmのアルゴンレーザーとTiをパルスした790 nmの140 fsは）ことを確認してください。 入口チャネルを形成するためにヒドロゲルを設定します ステージインサート上のヒドロゲルおよびペトリ皿を取り付け、顕微鏡ステージ上のステージインサートを配置します。 DI H 2 Oへの水浸対物レンズを下げる前に、目でDI H 2 Oセンターの少なくとも5 mLのハイドロゲルとよく機能してシャーレを埋めます注：目的-2でハイドロゲルを粉砕しないでください触れてはいけません！ ヒドロゲルを見つけるには、ステップ2.2から「ハイドロ見える化」設定に切り替えます。上のレーザーラインを回すと目を持参する「ライブ」をクリックしますヒドロゲルの上部の（CH1蛍光検出器で検出）エオシンY信号を見ることができるまで、ヒドロゲルに電子目的近いです。 注：簡単にヒドロゲルを検索するには、パーセントのパワーを大きくすることができ、またはピンホールを開くことができます。目的は、ヒドロゲルに焦点を当てされると、しかし、蛍光検出器を保護し、検出器の過飽和を避けるために、かつ正確にヒドロゲル表面を見つけるために戻って1AUにピンホールを減少させるパーセントの力をドロップします。 「ステージ」ウィンドウでは、ヒドロゲルの井戸の底の上下の位置をマーク。 注：Z値ここでは、ヒドロゲルの厚さと井戸の深さを決定するのに役立ちます。 ウェルのエッジを見つけるために、XとYに移動するにはジョイスティックを使用してください。 その逆も左でもして、画面の右側にハイドロゲルを置き、または。ヒドロゲルは、視野のない3分の2以上を埋めないように許可します。 plのドロップフォーカスダウン150μmの「フォーカス」ウィンドウ内の「150」「ステップサイズ」を設定し、「Z位置」ボックスの横にある下向きの矢印をクリックしてヒドロゲルへのANE。繰り返しステップ5.2.4、必要に応じて。 注：注入口のx、y及びzの位置は、単に仮想のマスクの設計に依存します。 CRITICAL：ゼロ「ステージ」ウィンドウで、XとYの位置は、他のすべての印を付けた位置を削除し、のみ、この場所をマーク。 注：このステップが実行されない場合は、顕微鏡のマクロが正常に以前に保存されているレシピに場所を復元しませんし、ヒドロゲルは、所望の位置に分解されることはありません。 入口チャネルを形成します 「スナップ」の画像と「地域」ウィンドウ内の四角形のボタンを使用して血管網への入口になる矩形領域を描画します。 注：地域のことを確認してください一部は番目のことを確保することは、十分に出て延びています電子入口は血管網にも接続します。 次の「リージョン」ウィンドウで生成されたROIに、「取得」を選択し、「ブリーチ」と「分析」を選択解除します。 「ヒドロゲルの可視化」設定を保存し、「地域」を選択解除し、ステップ2.3に設定し、「チャネル形成」設定に変更します。 「チャネル形成」設定では、「地域」を再度選択します。 注：「ヒドロゲルの可視化」と「チャネル形成」の設定を切り替えると、画面の左上にある領域を選択解除してください。これを行わない場合時には地域のスケーリングは、構成の間で予期せず変更することができます。 「チャネル形成」設定では、唯一の "地域"と "Zスタック」が選択されていることを確認します。 「Z-スタック」ウィンドウで、トップとし、 "センター"お尻で「センター」ボタンをクリックしてください上記の現在のZ位置などのzスタックの中心を設定するには、「オフセット」。入口があることが必要であるか大きいによって、「1」の「間隔」と「スライス」の数を設定します。 Z-スタックのサイズは、「範囲」の下に表示されます。 「取得モード」ウィンドウ内の「スピード」が「3」に設定し、「チャンネル」ウィンドウ内の「パーセントパワー」を「100」に設定されていることをされていることを確認してください。設定を保存し、「実験を開始」ボタンをクリックします。 注：入口チャネルを生成するために、ここで実行されるような顕微鏡マクロは、複数の面で同じ単純な形状を分解するために必要とされていません。各個々の平面上の異なる領域を分解するとき、マクロにのみ必要であり、レシピ内の仮想マスクを格納するために使用されます。 トンで地域場合は、「チャンネル」ウィンドウで分解中にハイドロゲルを視覚化し、いずれかの「ゲイン（マスター）」を増加させるために、彼の視野が黒で、または領域が白であれば「ゲイン（マスター）」を減少させます。 注：ここで気泡形成はレーザ誘起ヒドロゲル分解の指標です。 入口に一度だけ、複数回の代わりを分解するために、「時系列」ウィンドウ内の「サイクル」を調整します。 「ヒドロゲルの可視化」の構成では、入口が形成されたことを確認するために「ライブ」をクリックします。 マイクロ流体ネットワークを生成するためのハイドロゲルの設定 「リージョン」ウィンドウで、仮想マスクのzスタックから任意の.OVLファイルをロードし、視野内のROIを表示するには、矢印ボタンをクリックします。 「ヒドロゲルの可視化」の構成をスキャンして、入口は血管網内の正しい場所に接続するように、XとYにヒドロゲルを配置するために、ジョイスティックまたは「ステージ」ウィンドウを使用生きるために「ライブ」をクリックします。 注：確認してください仮想マスクのROIが先に形成された入口をわずかにオーバーラップします。 「フォーカス」ウィンドウ内の「ステップサイズ」を使用し、 "Zポジションの横にある下向きの矢印をクリックし、ダウン焦点面前回の中心Z-場所から50ミクロン、またはハイドロゲルの表面から200ミクロンをドロップ"ボックス。これは、顕微鏡、マクロの最初の位置になります。 注：z方向に移動する実際の距離は、ネットワーク設計に依存します。目的のネットワークは、z方向のヒドロゲルの上部または下部表面を越えて延びていないことを確認してください。 CRITICAL：ゼロ「ステージ」ウィンドウで、XとYの位置、他のすべての印を付けた位置を削除し、そして唯一のこの場所をマークします。 注：これは、顕微鏡マクロの出発点になります。レシピは、ハイドロゲルの表面に向かって戻すように動作します。 「スナップ」「ヒドロゲルの可視化」構成の画像、削除しdeselecトン「地域」、およびコンフィギュレーションを保存します。 マイクロ流体ネットワークの生成 「チャネル形成」設定に変更し、唯一の「時系列」と「漂白」ウィンドウを選択します。彼らが最初のステップ2.3.7および2.3.8で設定されたように、「時系列」と「漂白」ウィンドウの設定があることを確認します。 「8」を「取得モード」ウィンドウの「スピード」と「チャンネル」ウィンドウ内のレーザラインに「0.2」のパーセント電力を設定します。設定を保存します。 ステップ3.5以下の顕微鏡マクロを開きます。マクロの「保存」タブで、ステップ3から以前に作られたレシピを選択し、「適用」をクリックします。 注：「ストア」をクリックしないでくださいまたはレシピが上書きされます！ すべてのタブの設定を確認し、仮想マスク（.OVLファイル）がまだ正しくトンに関連付けられていることを確認ドロップダウンリストで、彼Z-場所。また、最初のZ位置は、顕微鏡ソフトウェアの「ステージ」ウィンドウでマークされた場所と一致することをご確認ください。 注：顕微鏡マクロは、ハイドロゲルの底からそのように動作しますよう反し、ドロップダウンリストの2番目の位置が（に最も近い（最も遠い目的から）ヒドロゲルの先頭に、最初の位置の上に物理的になります目的）。 再び「チャネル形成」の設定を保存し、顕微鏡マクロで「更新」をクリックします。 「現在位置のリストを上書きしますか？」に「いいえ」をクリックして、[レシピを開始するために、顕微鏡のマクロで「スタート」をクリックします。 6.マイクロ流体ネットワークの可視化ヒドロゲルと劣化後の形成された微小流体ネットワークを表示するには、顕微鏡のマクロを閉じます。エオシンYのsiを表示するには、 "ハイドロゲルの可視化」の設定に切り替えヒドロゲルのgnal。劣化したネットワークは暗く表示されます。 注：顕微鏡マクロの実行中にヒドロゲルの分解を視覚化することができません。 具体的には、マイクロ流体ネットワークを表示するには、ヒドロゲルのネイティブエオシンY信号よりも明るいシグナルを有する導入フルオレセイン（FITC）標識デキストランのイメージングを可能にするために低いレーザーパワーで「ヒドロゲルの可視化」の設定を使用します。 蛍光標識デキストランを導入する前に、ラボの組織を使用してヒドロゲルに井戸から水を吸い上げます。 DI H 2 O中5mg / mLの2000 kDaのFITC標識デキストランの10μL（0.2μmのシリンジフィルターを通して事前にフィルタ処理）でピペット。 注：ゲル中に拡散するのを防止するために、任意のデキストランのサイズの2,000キロダルトン以上を使用してください。イメージングは​​、より長い30分間、FITC標識したデキストラン溶液からヒドロゲルの乾燥および水の蒸発を防ぐために、60％の湿度（またはそれ以上）とインキュベートしたステージを使用する場合。 ヒドロゲルaを削除しますステージからのNDシャーレ以降の実験中に形成された血管網の容易な場所を有効にするには、ペトリ皿をマーク。