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Immunology and Infection

Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/55033
,
1Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

O desenvolvimento de um método amplamente aplicável, fácil e eficaz para a engenharia de um vector com tropismo restrito proporciona uma grande oportunidade para melhorar a segurança, a compreensão biológica e utilidade terapêutica de vírus. Existem vários mecanismos para atingir tropismo viral incluindo transdução, da transcrição, e as técnicas baseadas em translação. No entanto, estes métodos não são geralmente aplicáveis ​​a todos os sistemas de vectores, pode exigir vias de sinalização defeituosos em células alvo ou exigir a inserção de sequências codificadoras grandes no genoma viral. Além disso, esses métodos podem resultar na atenuação do vírus, o que dificulta significativamente a sua actividade terapêutica e limitando uma visão sobre o sistema não modificado.

MicroRNAs são pequenos (22-25 nucleótidos), RNAs não-codificantes que medeiam o silenciamento de genes em células eucarióticas. função MicroRNAs ligando sequências alvo complementares (elementos de resposta) em RNAs mensageiro (mRNA) resulti ng na desestabilização da transcrição, a degradação ou a repressão de translação. MicroRNAs normalmente ligam-se elementos de resposta com complementaridade parcial e produzir pequenas modificações na expressão do gene 1, 2, 3, 4, 5. Alterações mais significativas na expressão do gene pode ser conseguido aumentando a complementaridade do elemento de resposta a seis. Milhares de microARNs maduros têm sido identificados numa variedade de espécies e muitas exibem padrões de expressão diferenciais em uma variedade de tipos de células e tecidos 7, 8, 9. Estas assinaturas microRNA pode ser explorada para a restrição específica da célula de amplificação do vírus, incorporando elementos de resposta perfeitamente complementares ao genoma viral 10,= "xref"> 11, 12, 13. O objetivo geral desta técnica de metas de microRNA é controlar o tropismo de um genoma vector sem atenuação adicional.

A utilidade deste método para regular o tropismo viral foi inicialmente demonstrada em vectores lentivirais para restringir a expressão do transgene em tecidos específicos, 14, 15, 16. Esta técnica foi subsequentemente aplicada a uma vasta gama de replicar e não replicantes vectores virais para terapia génica aumentada, bem como para melhorar os perfis de segurança de muitos vírus oncolí ticos, eliminando toxicidades indesejadas em tecidos normais 10, 11, 12, 13, 17 . Também tem sido utilizado para gerar e e seguravacinas vivas atenuadas FICAZ, bem como para melhorar o vírus e fabrico de vacinas de processos 18, 19, 20, 21. MicroRNA-alvo de um vector pode permitir a atenuação em hospedeiros vacinados ou sistemas segmentados, mantendo níveis de crescimento do tipo selvagem em sistemas de produtores. MicroRNA-direccionamento podem também ser utilizadas para melhorar a segurança biológica do vírus para fins de investigação, restringindo a transmissão em uma espécie (por exemplo, seres humanos), mantendo a transmissão em outros hospedeiros 22. Finalmente, microRNA-alvo pode permitir análises em profundidade de ciclo de vida viral e papéis específicos de tipos de células em patogênese e imunidade por segregar o crescimento viral 23, 24, 25, 26.

Esta técnica oferece uma alternative método que pode ser facilmente implementada e aplicáveis ​​segmentação para todos os sistemas de vírus. Além disso, a recolha em constante expansão de microARNs maduras, com padrões de expressão diferenciais em tipos específicos de células torna esta técnica altamente versátil. -MicroRNA segmentação baseada provou eficaz para uma variedade de sistemas vírus sem comprometer a função do sistema. As principais limitações desta técnica incluem tentativa e otimização de erro, o potencial para mutações de escape, e potenciais efeitos fora do alvo em transcrições endógenos. No entanto, estas limitações geralmente podem ser superados com design otimizado e racional elemento de resposta. vírus de ARN de sentido positivo tende a ser particularmente sensível a microARN-direccionamento devido à orientação de sentido positivo do seu genoma e a disponibilidade dos transcritos à maquinaria microARN durante o ciclo de replicação completamente citoplasmática. Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar um picornavírus alvejado-microRNA eo experimmétodos ental para verificar a eficiência e especificidade de que a segmentação in vitro.

Protocol

1. Clonagem microARN Elementos de Resposta no genoma viral Projeto de microRNA inserções de elementos de resposta. Identificar o microRNA desejado e sua sequência alvo correspondente. Vários bancos de dados estão disponíveis com sequências de microRNA maduros. Recomendado: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30. …

Representative Results

A Tabela 1 representa os resultados típicos de um ensaio de titulação para um picornavírus e descreve a forma de calcular a dose infecciosa de cultura de tecido de 50%. Uma representação esquemática do conceito global de regulação baseada em microARN de tropismo viral descrito neste manuscrito é mostrado na Figura 1. A orientação do elemento de resposta para microARN durante interacções intracelulares, concepção adequada de elemento de re…

Discussion

A concepção, a composição e a localização dos elementos de resposta microARN dentro do genoma viral ditará segmentação eficácia e especificidade. Otimizar estes irão exigir tentativa e erro. No entanto, design racional baseada na análise estrutural de RNA e estudos anteriores de replicação viral e microRNA assinaturas auxilia na implementação dessa técnica com otimização mínima 10, 11, 12, <sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

Materials

RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System NEB M0202S
MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.
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