Reglamento basadas en microARN de picornavirus tropismo
Summary
We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.
Abstract
Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.
Introduction
El desarrollo de un método ampliamente aplicable, fácil y eficaz para la ingeniería de un vector con tropismo restringido ofrece una gran oportunidad para mejorar la seguridad, la comprensión biológica y utilidad terapéutica de los virus. Existen varios mecanismos para orientar tropismo viral incluyendo transduccional, de la transcripción, y las técnicas basadas en la traducción. Sin embargo, estos métodos no son aplicables en general a todos los sistemas de vectores, pueden requerir vías de señalización defectuosos en las células diana o requerir la inserción de grandes secuencias de codificación en el genoma viral. Además, estos métodos pueden dar lugar a la atenuación del virus, lo que dificulta considerablemente su actividad terapéutica y la limitación de penetración en el sistema sin modificar.
Los microARN son pequeñas (22-25 nucleótidos), los ARN no codificantes que median el silenciamiento de genes en células eucariotas. Los microARN función de secuencias diana complementarias (elementos de respuesta) en unión a ARN mensajeros (ARNm) resultadoi ng en la desestabilización transcripción, la degradación o la represión de traducción. MicroARNs normalmente se unen elementos de respuesta con complementariedad parcial y producen pequeñas modificaciones en la expresión génica 1, 2, 3, 4, 5. Más alteraciones significativas en la expresión génica se puede lograr mediante el aumento de la complementariedad del elemento de respuesta a 6. Miles de microRNAs maduros se han identificado en una variedad de especies y muchos patrones de expresión diferenciales de exposiciones en una variedad de tipos de células y tejidos 7, 8, 9. Estas firmas de microARN pueden ser explotados para la restricción específica de la célula de amplificación de virus mediante la incorporación de elementos de respuesta perfectamente complementarias en el genoma viral 10,= "xref"> 11, 12, 13. El objetivo general de esta técnica microRNA objetivo es controlar el tropismo de un genoma vector sin atenuación adicional.
La utilidad de este método para regular el tropismo viral se demostró originalmente en vectores lentivirales para restringir la expresión del transgén en tejidos específicos 14, 15, 16. Esta técnica posteriormente se ha aplicado a una amplia gama de replicarse y no replicante vectores virales para la terapia génica mejorada, así como para mejorar los perfiles de seguridad de muchos virus oncolíticos mediante la eliminación de las toxicidades no deseadas en los tejidos normales 10, 11, 12, 13, 17 . También se ha utilizado para generar seguro y evacunas vivas atenuadas EFECTIVA, así como para mejorar virus y fabricación de vacunas procesos 18, 19, 20, 21. El microARN-focalización de un vector puede permitir que la atenuación en huéspedes vacunados o sistemas específicos, manteniendo los niveles de crecimiento de tipo salvaje en los sistemas de producción. MicroRNA orientación también puede utilizarse para mejorar la seguridad de la biotecnología de los virus para fines de investigación mediante la restricción de la transmisión en una especie (por ejemplo, seres humanos) mientras se mantiene la transmisión en otros huéspedes 22. Por último, microRNA orientación puede permitir el análisis en profundidad de los ciclos de vida virales y las funciones específicas de tipos de células en la patogénesis e inmunidad mediante la segregación de crecimiento viral 23, 24, 25, 26.
Esta técnica ofrece una alternative método que se implementa fácilmente aplicable y la orientación para todos los sistemas de virus. Además, la colección cada vez mayor de los microRNAs maduros con los patrones de expresión diferencial en tipos específicos de células hace que esta técnica altamente versátil. la focalización basada en microARN ha demostrado su eficacia para una variedad de sistemas de virus sin comprometer la función del sistema. Las principales limitaciones de esta técnica incluyen el juicio y la optimización de error, el potencial de mutaciones de escape, y los posibles efectos fuera de la meta en transcripciones endógenos. Sin embargo, estas limitaciones se pueden superar por lo general con un diseño optimizado y racional elemento de respuesta. los virus de ARN de sentido positivo tienden a ser particularmente sensible a microRNA-orientación debido a la orientación de sentido positivo de su genoma y la disponibilidad de los transcritos a la maquinaria microRNA durante el ciclo de replicación completamente citoplasmática. Aquí se describe un protocolo para la generación de un picornavirus microRNA específico y la experimentales métodos para verificar la eficiencia y la especificidad de que la selección in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
El diseño, composición y localización de los elementos de respuesta microRNA dentro del genoma viral dictarán la orientación eficacia y especificidad. La optimización de los cuales habrá que ensayo y error. Sin embargo, el diseño racional basado en el análisis estructural del ARN y estudios previos de la replicación viral y microARN firmas auxiliares en la aplicación de esta técnica de optimización con un mínimo de 10, 11, <sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.
Materials
| RE encoding Oligonucleotides | IDT | PAGE-Purified Ultramer | Sequence Designed by Investigator |
| Oligonucleotides encoding unique restriction site | IDT | 25nM | Sequence Designed by Investigator |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Sigma Aldrich | 11732641001 | Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available |
| T4 DNA Ligase System | NEB | M0202S | |
| MEGAscript Kit | ThermoFisher Scientific | AM1333 | |
| MEGAclear Kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | AM9260G | RNase-free |
| 5 M NH4 Acetate | ThermoFisher Scientific | N/A | Comes in MEGAclear Kit |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| Nuclease-free Water | Fisher Scientific | AM9938 | |
| TransIT-2020 Transfection Reagent | Mirus | MIR 5404 | |
| TransIT-mRNA Transfection Reagent | Mirus | MIR 2225 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 2mL Screw-Cap Tubes | Sarstedt | 72.694.005 | |
| Cell Scrapers | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| MicroRNA Mimics | Dharmacon | Varied | |
| MTT Cell Proliferation Assay | ATCC | 30-1010K | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | ThermoFisher Scientific | 18265017 | |
| pBlueScript II Vectors | Agilent Technologies | Variable (e.g. 212205) | There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription. |
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