Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em> İn Vitro</em> Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up
Summary
Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.
Abstract
Uygun nöronal gelişim ve fonksiyon gelişen ve yetişkin beyin ön koşuldur. Bununla birlikte, kompleks nöronal ağların son derece kontrollü oluşumu ve bakım altında yatan mekanizmaları tam bugüne kadar anlaşılamamıştır. Sağlıkta ve hastalıkta nöronlar ile ilgili açık sorular insan ile ilgili patolojiler, örneğin, Alzheimer hastalığı ve Şizofreni soruşturma temel gelişmeyi anlamaktan çeşitli ve kapsamlıdır. Nöronların en ayrıntılı analizi, in vitro olarak yapılabilir. Ancak, nöronlar hücreleri talep ve uzun vadeli hayatta kalmak için astrositlerin ek desteğe ihtiyacı vardır. Bu hücresel heterojenlik nöron ve astrositlerin analizini incelemek amacıyla çelişmektedir. Fiziksel olarak ederken, aynı burada kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam paylaşan saf birincil nöronlar ve astrositler, uzun süreli birlikte yetiştirme için izin veren bir hücre kültürü tahlil mevcutayrıldı. Bu ayarda, kültürler en fazla dört hafta boyunca hayatta ve tahlil nöron glia etkileşimine ilişkin araştırmaların bir çeşitlilik için uygundur.
Introduction
Geçtiğimiz yıllar içinde, nöroglia fonksiyonunun genel yorumlama nöronal fonksiyonu 1 ile ilgili aktif bir düzenleyici rolüne yönelik bir sadece destekleyici bir atıf dönüşmüştür. Çünkü sağlık ve hastalık 2 beyin homeostazisi üzerindeki belirgin etkisi, astrositler bilimsel topluluk için özel bir öneme sahiptir. Son birkaç yıl içinde, çalışmalar çeşitliliği in vivo ve in vitro 3 nöron-glia etkileşimlerine odaklanmıştır. Ancak, kültür sistemlerinin çoğu, her iki hücre tiplerinin ayrı bir analiz için ve ilgili secretomes arasında izin vermez.
Çeşitli yaklaşımlar uzun ömürlü sağkalım ve fizyolojik ilgili nöronal ağ geliştirme 4-6 ulaşmak için nöronların ve glia doğrudan kültürleştirilmeye istifade eder. Fiziksel olarak 7 ayrı iki hücre tipleri tutarken mevcut protokol aynı hedefleri ulaşır. conditione karşılaştırıldığındad orta sistemimiz nöronlar ve astrositler arasındaki çift yönlü iletişimi çalışma sağlar, 8,9 yaklaşır. Hücreler paylaşılan ortam içinde olgunlaşmak ise salgılanan sinyal molekülleri ekspresyonu izlenebilir. Astrositler ve böylece sinir hücresi büyümesini düzenleyen, sitokinler, büyüme faktörleri ve hücre dışı matris moleküllerinin 10,11 gibi çözünür faktörlerin, serbest ve 7,12 fonksiyonu olarak fırsat ilişkindir. Nedenle, in vitro olarak, retinal bez hücrelerin trombospondin eklenmesi sinaps 13 oluşumunu uyardığını ortaya konmuştur. Bununla birlikte, diğer henüz bilinmeyen faktörler 13 fonksiyonel sinaps oluşturmak için gereklidir. Ayrıca, astrositler tarafından yayımlanan moleküller nöron glia etkileşimleri temelini anlamak için tespit edilmelidir.
Fare ve sıçan primer nöron ve astrositler ekimi önce 14-16 tarif edilmiştir. buradadolaylı kokültürünün yaklaşımla hem hücre tipleri birleştirmek için zarif ve çok yönlü bir araç sunuyoruz. iki kültür fiziksel ama aynı ortam, nöronlar, astrositler ve çözünür moleküllerin etkisi, dövme ayrılmış olması nedeniyle, ayrıca bu şekilde nöron glia etkileşim çalışmaları için güçlü bir araç sunar analiz edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Paylaşılan ortamda bunları korurken mevcut protokolün temel amacı, tamamen ayrı nöronal ve astrositik kültürler etmektir. Bu nedenle, elde edilen kültürlerin saflığı prosedürü başlangıcında kontrol edilmelidir. Biz nöronal belirteç olarak nöron-spesifik tubulin, nörofilament veya Neun proteininin kullanılmasını tavsiye, GFAP astrositik işaretleyici olarak, oligodendrosit öncüsü işareti ve Iba1 protein olarak O4 antijen mikroglia tanımlamak için.
protokol krit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
