Непрямой Нейрон-астроцитов Анализ Совместное культивирование:<em> In Vitro</em> Настройка для детального исследования Нейрон-глии взаимодействий
Summary
Этот протокол описывает косвенную нейрон-астроцитов сокультивирования для анализа на секции нейрон-глиальных взаимодействий.
Abstract
Правильное развитие нейронов и функции является предпосылкой развивающегося и взрослого мозга. Однако механизмы, лежащие в основе высоко контролируемого формирования и поддержания сложных нейронных сетей не совсем понятны до сих пор. Открытые вопросы , касающиеся нейронов в области здравоохранения и болезни разнообразны и идущие от понимания базового развития к исследованию патологий , связанных с человека, например, болезнь Альцгеймера и шизофрения. Наиболее детальный анализ нейронов может быть выполнена в пробирке. Тем не менее, нейроны требуют клетки и нуждаются в дополнительной поддержке астроцитов для их выживания в долгосрочной перспективе. Эта клеточная гетерогенность находится в конфликте с целью расчленения анализа нейронов и астроцитов. Мы представляем здесь анализ клеточной культуры, которая позволяет для долгосрочного совместного культивирования чистых первичных нейронов и астроцитов, которые разделяют ту же химически определенной среде, в то же время физическиразделены. В этой установке, культуры выжить в течение до четырех недель, и анализ подходит для разнообразия исследований, касающихся взаимодействия Нейрон-глии.
Introduction
На протяжении последних десятилетий, общая интерпретация функции нейроглия превратилась из приписывание лишь поддерживает к активной регулирующей роли в отношении функции нейронов 1. Из – за их влияния на видных гомеостаза мозга в здоровье и болезни 2, астроциты представляют особый интерес для научного сообщества. За последние несколько лет, разнообразие исследований были сосредоточены на нейрон-глиальных взаимодействий в естественных условиях и в пробирке 3. Тем не менее, большинство систем культивирования не позволяют проводить раздельный анализ обоих типов клеток и их соответствующих secretomes.
Несколько подходов используют прямое сокультивации нейронов и глии для достижения длительное выживание и физиологически соответствующее развитие нейронной сети 4-6. Настоящий протокол достигает тех же целей, сохраняя при этом оба типа клеток физически разделенных 7. По сравнению с conditioned среда приближается к 8,9, наша система позволяет исследовать двунаправленную связь между нейронами и астроцитов. Экспрессия секретируемых сигнальных молекул может контролироваться в то время как клетки нагноиться в совместно используемой среде. Эта возможность особенно актуальна, так как астроциты выпустить растворимые факторы, такие как цитокины, факторы роста и внеклеточных матричных молекул 10,11, тем самым регулируя нейронную рост и функционирование 7,12. Таким образом, было показано , что добавление к Тромбоспондин ганглиозных клеток сетчатки в пробирке индуцирует образование синапсов 13. Тем не менее, другие еще неизвестные факторы , которые необходимы для визуализации синапсы функциональных 13. Кроме того, молекулы, выпущенные астроцитов должны быть определены для того, чтобы понять основы нейрон-глиальных взаимодействий.
Культивирование первичных нейронов и астроцитов от мышей и крыс было описано ранее 14-16. Мы тутпредставляет элегантный и универсальный инструмент для объединения обоих типов клеток в косвенном сокультивирования подхода. Так как эти две культуры физически разделены еще разделяя ту же среду, влияние нейронов, астроциты и растворимых молекул, могут быть проанализированы по отдельности, создавая тем самым мощный инструмент для исследования взаимодействия нейрон-глия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основной целью текущего протокола является полностью отдельными нейронными и астроцитарные культуры, сохраняя при этом их в общей среде. По этой причине, чистота культур, полученных должно быть проверено в начале процедуры. Мы рекомендуем использовать нейрон специфические тубулина, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
