La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em> In Vitro</em> Set-up per l'indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia
Summary
Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.
Abstract
Corretto sviluppo e la funzione neuronale è il presupposto di sviluppo e il cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi alla base della formazione altamente controllato e manutenzione di reti neuronali complesse sono state comprese finora. Le questioni aperte in materia di neuroni nella salute e nella malattia sono diversi e si estende da comprendere lo sviluppo di base per indagare le patologie legate umani, per esempio, il morbo di Alzheimer e la schizofrenia. L'analisi più dettagliata dei neuroni può essere eseguita in vitro. Tuttavia, i neuroni sono esigenti cellule e hanno bisogno del sostegno supplementare degli astrociti per la loro sopravvivenza a lungo termine. Questa eterogeneità cellulare è in conflitto con l'obiettivo di analizzare l'analisi di neuroni e astrociti. Presentiamo qui un test di coltura cellulare che consente la co-coltivazione a lungo termine di neuroni primari puri e astrociti, che condividono lo stesso mezzo chimicamente definito, pur essendo fisicamenteseparato. In questa configurazione, le culture sopravvivono per un massimo di quattro settimane e il test è adatto per una varietà di indagini riguardanti l'interazione neuroni-glia.
Introduction
Nel corso degli ultimi decenni, l'interpretazione generale della funzione nevroglia si è evoluta da l'attribuzione di un solo supporto verso un ruolo regolatore attivo per quanto riguarda la funzione neuronale 1. A causa del loro impatto di rilievo sulla omeostasi del cervello in salute e malattia 2, astrociti sono di particolare interesse per la comunità scientifica. Negli ultimi anni, una diversità di studi si sono concentrati sulle interazioni neuroni-glia in vivo e in vitro 3. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di coltura non consentono per l'analisi separata delle due tipi cellulari e dei rispettivi secretomes.
Diversi approcci sfruttano la co-coltivazione diretta dei neuroni e glia per raggiungere la sopravvivenza di lunga durata e fisiologicamente rilevanti di sviluppo della rete neuronale 4-6. Il presente protocollo raggiunge gli stessi obiettivi, mantenendo entrambi i tipi di cellule separate fisicamente 7. Rispetto al conditioned media si avvicina a 8,9, il nostro sistema permette di studiare la comunicazione bidirezionale tra neuroni e astrociti. L'espressione di molecole di segnalazione secrete può essere monitorato mentre le cellule maturare nel mezzo condiviso. Questa opportunità è particolarmente rilevante, come astrociti rilasciano fattori solubili, come le citochine, fattori di crescita e molecole della matrice extracellulare 10,11, regolando così la crescita neuronale e funzionano 7,12. Pertanto, è stato dimostrato che l'aggiunta di trombospondina alle cellule gangliari retiniche in vitro induce la formazione di sinapsi 13. Tuttavia, sono necessari per rendere sinapsi funzionali 13 altri fattori ancora sconosciuti. Inoltre, molecole rilasciate dagli astrociti devono essere identificati al fine di comprendere la base delle interazioni neuroni-glia.
La coltivazione di neuroni primari e astrociti di topo e ratto è stato descritto in precedenza 14-16. Qui noipresentare uno strumento elegante e versatile per combinare entrambi i tipi cellulari in un approccio co-coltura indiretta. Poiché le due culture sono fisicamente separati ancora condividere lo stesso mezzo, l'impatto di neuroni, astrociti e molecole solubili, possono essere analizzate separatamente, creando così un potente strumento per studi di interazione neuroni-glia.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo principale del protocollo attuale è quello di colture neuronali e astrociti completamente separati, mentre li mantenendo in mezzo condiviso. Per questo motivo, la purezza delle colture ottenute vanno verificate all'inizio del procedimento. Si consiglia l'uso di tubulina specifica dei neuroni, neurofilamenti o proteine NeuN come marcatori neuronali, GFAP come marcatore astrociti, O4 antigene come marcatore degli oligodendrociti precursore e proteine Iba1 per identificare microglia. </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
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