פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.
התפתחות עצבית תקינה ותפקוד הוא התנאי ההכרחי של הפיתוח ו במוח הבוגר. עם זאת, המנגנונים להיווצרות מאוד מבוקר ותחזוקה של רשתות נוירונים מורכבות אינם מובנים לחלוטין עד כה. השאלות הפתוחות בנוגע נוירונים בבריאות ובחולי מגווני לכת להבנת ההתפתחות הבסיסית לחקירת פתולוגיות הקשורות אדם, למשל, מחלת אלצהיימר וסכיזופרניה. הניתוח המפורט ביותר של נוירונים יכול להתבצע במבחנה. עם זאת, נוירונים דורשים תאים זקוקים לתמיכה נוספת של האסטרוציטים להישרדות ארוכת הטווח. ההטרוגניות הסלולר זהו בסכסוך במטרה לנתח את הניתוח של נוירונים האסטרוציטים. אנו מציגים כאן assay תא-תרבות המאפשר cocultivation ארוכת הטווח של הנוירונים העיקריים טהור האסטרוציטים, אשר חולקים את אותה בינוני הגדרה כימית, בעת היותו פיזיתמופרד. במצב זה, התרבויות לשרוד במשך עד ארבעה שבועות assay הוא מתאים למגוון של חקירות לגבי האינטראקציה נוירון, גליה.
במהלך העשורים האחרונים, הפרשנות הכללית של תפקוד תאי גלייה התפתחה מן הייחוס של תומכת רק לקראת תפקיד רגולציה פעיל בדבר עצבי פונקציה 1. בגלל ההשפעה הבולטת שלהם על הומאוסטזיס המוח בבריאות ובחולי 2, האסטרוציטים הם בעלי עניין מיוחד עבור הקהילה המדעית. בשנים האחרונות, מגוון של המחקרים התמקדו נוירון, גליה אינטראקציות in vivo ו במבחנה 3. עם זאת, רוב מערכות התרבות אינו מאפשרים הניתוח הנפרד של שני סוגי התאים ושל secretomes שלהם.
גישות מספר לנצל את cocultivation הישיר של נוירונים גליה להשיג הישרדות לאורך זמן ופיתוח רשת עצבית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 4-6. הפרוטוקול הנוכחי מגיע את אותן מטרות, תוך שמירה על סוגי תאים הן מופרדות 7 פיזית. לעומת conditioneבינוני ד גישות 8,9, המערכת שלנו מאפשרת ללמוד את בתקשורת דו-כיוונית בין הנוירונים האסטרוציטים. הביטוי של מולקולות איתות מופרשים ניתן לנטר תוך התאים לְהַבשִׁיל במדיום המשותף. הזדמנות זה רלוונטית במיוחד, כמו האסטרוציטים לשחרר גורמים מסיסים, כגון ציטוקינים, גורמי גדילה ומולקולות מטריקס 10,11, ובכך ויסות צמיחה עצבית ולתפקד 7,12. לפיכך, הוכח כי תוספת של thrombospondin לתאי הגנגליון ברשתית במבחנה גורם להיווצרות של סינפסות 13. עם זאת, אחרים עדיין גורמים לא ידועים נחוצים כדי להבהיר סינפסות 13 פונקציונלית. יתר על כן, מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים צריכות להיות מזוהות כדי להבין את הבסיס של נוירון, גליה אינטראקציות.
הטיפוח של נוירונים עיקרי האסטרוציטים מעכבר והחולדה תואר בעבר 14-16. הנה אנחנולהציג כלי אלגנטים צדדי לשלב בין שני סוגי התאים בגישת coculture עקיפה. מאז שתי התרבויות מופרדים פיזית עדיין חולקים את אותו בינוני, ההשפעה של נוירונים, האסטרוציטים ומולקולות מסיסים, ניתן לנתח בנפרד, ובכך ליצור כלי רב עוצמה עבור מחקרים אינטראקציה נוירון, גליה.
המטרה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא תרבויות עצביות ו astrocytic נפרדים לחלוטין, תוך שמירה על אותם במדיום משותף. מסיבה זו, את הטוהר של תרבויות המתקבל צריך להיות מאומת בתחילת ההליך. אנו ממליצים על שימוש של טובולין נוירון ספציפי, neurofilaments או חלבון NeuN כמו סמנים עצביים, GFAP כסמ?…
The authors have nothing to disclose.
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Reagents | |||
B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
Cell culture grade water | MilliQ | ||
Cell culture grade water | MilliQ | ||
Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
DNAse | Worthington | LS002007 | |
Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
Glucose | Serva | 22700 | |
HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
Papain | Worthington | 3126 | |
PBS | self-made | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
Equipment | |||
24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
Binocular | Leica | MZ6 | |
Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
Microscope | Leica | DMIL | |
Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
Water bath | GFL | Water bath type 1004 |